Collagenase (Type D, animal free)

储存液配制
1. 向 100 mg 胶原酶中加入 1 mL HBSS (Hank 平衡盐溶液，含 Ca2+、Mg2+)，震荡使其充分溶解，制备成 100 mg/mL (即 100×) 的储存液；
2. 使用低蛋白结合性的 0.22 μm 滤膜过滤除菌，立即使用或分装成小份量，于 -20°C 到 -5°C 避光冻存；
3. 使用前在冰上解冻，避免反复冻融。用于组织和细胞分散的常用浓度为：0.5-2.5 mg/mL，用于软骨消化的常用浓度为 1-2 mg/mL，需要根据特定的实验条件或者参考相应的文献资料确定所需的最佳工作浓度。
组织分离
1. 使用无菌手术刀或剪刀将组织切成 3-4 mm 大小的组织块；
2. 利用含 Ca2+、Mg2+ 的 HBSS 洗涤组织块数次；
3. 加入足量的含 Ca2+、Mg2+ 的 HBSS，使其浸没组织块，并加入胶原酶至需要工作浓度；
4. 于 37℃ 孵育 4-18 h。消化时使用水平摇床以及用 3 mM 的 CaCl2 补充消化可以提高消化效率；
5. 已分散开的细胞可使用不锈钢或尼龙网筛筛得，收集备用。未完全解离的组织另外添加适量的新鲜胶原酶工作液于 37°C 继续孵育，进一步消化；
6. 利用不含胶原酶的 HBSS 洗涤收集的细胞数次；
7. 细胞培养液重悬上述细胞，利用自动细胞计数器或其他方法计算活细胞密度；
8. 于细胞培养皿上利用合适细胞培养基接种细胞。
器官灌注
1. 向 37°C 预热的含Ca2+、Mg2+ 的 HBSS 中加入胶原酶，另添加 3 mM 的 CaCl2 有助于提高分离效率；
2. 按照已优化的速率对相应的器官灌注胶原酶工作液；
3. 将上述过程中回收的灌注液流经不锈钢或尼龙网筛，从而将已解离的细胞或小片段组织块与较大团块分离开来，未充分解离的组织需利用新鲜胶原酶工作液于 37°C 进一步孵育。
4. 步骤同组织分离 6-8。