自噬为蛋白质和细胞器等细胞质内成分自主降解的过程，研究发现它在衰老、神经退行性疾病等研究中发挥了重要的作用。
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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自噬为蛋白质和细胞器等细胞质内成分自主降解的过程，研究发现它在衰老、神经退行性疾病等研究中发挥了重要的作用。随着研究的深入，很多研究者需要确认自噬过程与自噬诱导或自噬溶酶体的抑制的关系，因此自噬流的研究至关重要。
本试剂盒包含了自噬体和自噬溶酶体检测染料（DAPRed）和自噬体检测染料（DALGreen）和溶酶体酸化抑制剂（bafilomycin A1），可准确的检测早期自噬的行程、自噬溶酶体与最终的消化降解过程。[1]
本试剂盒包含用于检测自噬体和自噬溶酶体的(DAPRed - Autophagy Detection）、用于检测自噬溶酶体的 (DALGreen - Autophagy Detection)和溶酶体酸化抑制剂 Bafilomycin A1，只需添加这几款试剂，就能实验自噬体形成到自噬溶酶体的全过程。[2][3]
References:
[1] H. Sakurai, et al., "Development of small fluorescent probes for the analysis of autophagy kinetics“, iScience, 2023, 26, 107218.
[2] X. Chen, et al, "Chaiqi decoction ameliorates vascular endothelial injury in metabolic syndrome by upregulating autophagy, Am J Transl Res., 2020, 12(9):4902-4922.
[3] C. Oh, et al, "S-Nitrosylation of p62 Inhibits Autophagic Flux to Promote α-Synuclein Secretion and Spread in Parkinson's Disease and Lewy Body Dementia, J Neurosci., 2022, 42(14), 3011-3024.
制备1 mmol/DALGreen 的DMSO 储存液
加10 μl DMSO至含有10 nmol DALGreen的管中，用移液器吹打混匀。
*DALGreen DMSO储存液请在-20℃保存，可以保存1个月。
制备0.1 mmol/l DAPRed的DMSO 储存液
加20 μl DMSO至含有2 nmol DAPRed的管中，用移液器吹打混匀。
*DAPRed DMSO储存液请在-20℃保存，可以保存1个月。
制备DALGreen/DAPRed 工作液
用培养基稀释DALGreen DMSO储存液，至DALGreen 终浓度为1.0μmol/l。
用培养基稀释DAPRed DMSO储存液，至DAPRed 终浓度为0.2μmol/l。
*制备1ml的DALGreen/DAPRed工作液：加1 μl DALGreen DMSO储存液和2 μl DAPRed DMSO储存液至1ml培养基中。
*DALGreen/DAPRed 工作液无法保存，请在配制后当天用完。
制备Bafilomycin A1 DMSO储存液
加24 μl DMSO至含有Bafilomycin A1的管中，用移液器吹打混匀。
*Bafilomycin A1 DMSO储存液请在-20℃保存，可以保存1个月。
制备Bafilomycin A1工作液
用不含氨基酸的培养基稀释Bafilomycin A1 DMSO储存液2,000-10,000倍，制备成Bafilomycin A1工作液。
*要根据不同的细胞种类确定不同的Bafilomycin A1工作液最佳浓度。请参考预实验来决定最佳浓度(推荐稀释2,000倍)
*Bafilomycin A1工作液不能保存，请在制备后当天用完。
预实验
检测条件的优化
由于自噬能力随细胞种类变化而变化，因此建议预先优化检测条件。当您第一次使用本产品或细胞种类 改变时，请参考以下操作步骤来优化DALGreen/DAPRed 的染色浓度、 Baf.A1 的浓度、处理时间来得到DALGreen/DAPRed 的信号变化，如下表所示：
|
信号变化 |
DALGreen/DAPRed工作液 |
|||
|
|
饥饿组 (和对照组比较) |
Baf.A1组 (和饥饿组比较) |
推荐浓度(μmol) |
浓度范围(μmol) |
|
DALGreen |
↑ |
↓ |
1 |
0.5-2 |
|
DAPRed |
↑ |
↑或→ |
0.2 |
0.05-0.2 |
|
Baf.A1工作液 |
||||
|
|
推荐处理时间(min) |
时间范围(min) |
推荐浓度 |
浓度范围 |
|
Baf.A1 |
20 |
20-40 |
2,000倍 |
2,000-10,000倍 |
1. 在培养皿中接种细胞并在37℃5% CO₂ 培养箱中培养。
2. 更换培养基，用培养基清洗细胞2次。
3. 加 入DALGreen/DAPRed 工作液，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养30 min。
4. 去除上清液，用培养基清洗细胞2次。
5.在以下条件下制备样品：
-对照组：在培养皿中加入培养基，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养2h 20 min。
-饥饿诱导组：在培养皿中加入不含氨基酸的培养基，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养2h 20 min。
-抑制自噬溶酶体组：在培养皿中加入不含氨基酸的培养基，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养2h, 去除上清液，加入Bafilomycin A1工作液，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养20 min。
6.在荧光显微镜下观察细胞。
*成像分析可能会受到Baf.A1 的稀释倍数、处理时间和加入时间的影响，请参考产品网页Q&A。
*BafA1 的检测实例请参考说明书中的实验例和产品网页。
*由于细胞种类不同，可能很难区分饥饿诱导组，Baf.A1处理组和对照组之间的区别，请参照以上信息优化DALGreen/DAPRed工作液浓度。
操作步骤
有多种针对自噬的诱导剂和抑制剂，请根据所加入的诱导剂和抑制剂来选择合适的实验方法。
自噬抑制剂长时间处理会影响细胞功能，因此根据抑制剂的不同，请考虑2种方案：
“饥饿诱导和自噬抑制剂同时处理”或“饥饿诱导后自噬抑制剂短时间处理”。
*诱导剂和抑制剂的检测实例请参考产品网页Q&A。
*如果药物的效果未知，请做以下2个实验来确认是自噬诱导还是自噬抑制?
自噬诱导确认
1. 在培养皿中接种细胞并在37℃5%CO₂ 培养箱中培养。
2. 更换培养基，用培养基清洗细胞2次。
3. 加入DALGreen/DAPRed工作液，在37℃5% CO₂培养箱中培养30 min。
4.去除上清液，用培养基清洗细胞2次。
5.按照下列条件制备样品
在自噬诱导剂情况下
-对照组：在培养皿中加入培养基，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养24 h。
-自噬诱导组：在培养皿中加入含有自噬诱导剂的培养基，在37℃5%CO₂ 培养箱中培养24 h。
在饥饿诱导情况下
-对照组：在培养皿中加入培养基，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养2h。
-饥饿诱导组：在培养皿中加入不含氨基酸的培养基，在37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养2 h。
6.在荧光显微镜下观察细胞染色情况。
*必要时可以清洗细胞。
自噬抑制确认
1. 在培养皿中接种细胞并在37℃5% CO₂ 培养箱中培养。
2.更换培养基，用培养基清洗细胞2次。
3. 加入DALGreen/DAPRed工作液，在37℃5% CO₂培养箱中培养30 min。
4.去除上清液，用培养基清洗细胞2次。
5.按照下列条件制备样品
在饥饿诱导/自噬抑制剂同时处理时
-对照组：在培养皿中加入培养基，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养2h。
-饥饿诱导组：在培养皿中加入不含氨基酸的培养基，在37℃5% CO₂培养箱中培养2h。
-自噬抑制组：在培养皿中加入含有自噬抑制剂不含氨基酸的培养基，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养2h。
在自噬抑制剂后处理时
-对照组：在培养皿中加入培养基，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养2h 20 min。
-饥饿诱导组：在培养皿中加入不含氨基酸的培养基，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养2 h 20 min。
-自噬抑制组：在培养皿中加入不含氨基酸的培养基，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养2h。去除上清液，加入含 有自噬抑制剂不含氨基酸的培养基，在37℃5% CO₂ 培养箱中培养20 min。
6.在荧光显微镜下观察细胞染色情况。
*必要时可以清洗细胞。
*自噬抑制剂的实验例，请参考产品页面。
| Components | Quantity |
| DALGreen | 10 nmol x 1 |
| DAPRed | 2 nmol x 1 |
| Bafilomycin A1 | x 1 |
| ※注意:由于Baflomycih A1的量极少，肉眼几乎看不见，请小心取用。 | |
| 应用&特点 | ● 无需转染，添加试剂即可轻松检测自噬流
● 试剂盒包含实验所需的溶酶体酸化抑制剂 |
| 运输方式 | Ship with Room temperature. |
| 储存条件 | -20°C, protected from light, stored in nitrogen |
| 用途 | 仅供研究使用!不能用于人体。 |
Quality Control & SDS
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