本方案仅提供指导,请根据您的实际需要进行修改。
1.溶液配制
取适量L 012 sodium salt粉末溶于纯水中,使成20mM储存液,母液冷冻保存,避免反复冻融。在后续实验中,可使用PBS(pH 7.5)进行稀释为工作液。
2.细胞ROS成像[1]:
(1)细胞处理:将细胞在白色透明底96孔培养板上生长至90%汇合,使用不同浓度H2O2刺激细胞。
(2)L 012 sodium salt孵育:将细胞培养基替换为补充有L 012 sodium salt (400µM)的PBS (pH 7.4)溶液中进行孵育5-10min。
(3)荧光检测:使用酶标仪在450nm处检测荧光值。
2.体内ROS成像[2]:
(1)制备工作液:取适量L 012 sodium salt母液溶于PBS中,使成30-60mg/kg。
(2)动物处理:提前异氟烷麻醉小鼠,并将小鼠成像处进行脱毛。
(3)将溶解好的L 012 sodium salt腹腔注射于小鼠体中,每只250μL。
(4)在注射L 012 sodium salt后,使用生物发光成像仪检测发光信号,每两分钟采集一次图像,总共采集50min。
Reference:
[1] Al Ghouleh I, Meijles D N, Mutchler S, et al. Binding of EBP50 to Nox organizing subunit p47 phox is pivotal to cellular reactive species generation and altered vascular phenotype[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016, 113(36): E5308-E5317.
[2] Rice, Christopher M., et al.Tumour-elicited neutrophils engage mitochondrial metabolism to circumvent nutrient limitations and maintain immune suppression. Nature communications 9.1 (2018): 5099.