2×Taq PCR Master Mix(with blue dye)

常见问题

可能原因

解决方案

PCR产物没有或非常少

引物设计不佳。

选择适当的引物设计软件进行引物设计。

待扩增片段GC含量偏高或片段长。

推荐使用更适合的DNA聚合酶如2×Taq PCR Fusion-Fast Mix(with blue dye) (目录：GK10036)。

退火温度不佳；延伸时间太短；循环数太少。

优化PCR实验条件。

模板浓度过低；实验样品 DNA损伤或降解。

适当加大模板量；重新制备模板。

模板质量太差。

用适当的DNA纯化方法纯化模板DNA（例如柱纯化）。

引物浓度过低；Mg²⁺浓度未优化。

适当调整引物浓度及Mg²⁺浓度。

扩增特异性差，非特异性扩增

引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体。

降低引物浓度，必要时重新设计引物。

模板质量差；模板被污染或降解。

通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板。

PCR循环条件未优化。

如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度，降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数。

空白对照出现扩增产物

引物设计不合理。

扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可以扩增出非靶序列的序列，重新设计引物。

反应体系污染。

若扩增产物条带大小与目的条带不一致，说明有污染；更换新的Mix、水或引物重复实验；反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。

扩增的条带亮度不够

引物降解。

检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解，必要可更换引物。

模板质量。

首先确认模板的质量，长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，制备新鲜DNA作为模板；如果模板没有了，可用首次扩增产物按倍比稀释后作为模板进行二次扩增。

酶浓度不佳。

可适当提高酶的使用量。

PCR循环条件未优化。

可尝试使用Touch Down程序；延长延伸时间，提高循环数。