Phalloidin-AMCA Conjugate

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。

1、制备染色液

（1）染料储存液: 取低温保存的染料储存液置于室温回温至少20min，低速离心将产品集中在管底，按照单次用量对储存液进行分装，置于-20℃避光保存，一年稳定；

（2）染料工作液: 本产品以1000xDMSO储存液形式提供，建议使用PBS (本方案使用的PBS均为pH7.4的1xPBS)按照1:1000的比例稀释储存液，将其稀释到1x染色工作液，用枪吹打混匀。

注意:

①  请根据实际情况调整及优化工作液浓度，现用现配。

② 可使用含1% BSA的PBS稀释储存液，能够降低非特异背景染色，也能最小化鬼笔环肽粘附到管壁的可能性。

2、细胞染色

（1）细胞爬片培养，生长达到70-80%的汇合度。

（2）吸弃培养液，用37°C预热的PBS清洗细胞2次。

（3）使用溶于PBS的4%多聚甲醛固定细胞，室温固定10min。

注意:

①  固定过程中甲醇能破坏肌动蛋白，建议使用无甲醇的固定液；

②  也可以在含3-4%福尔马林的PBS中室温固定细胞10-30分钟。

（4）室温下使用PBS清洗细胞2-3次，30s/次。

可选步骤①：用含10 mM乙醇胺（或0.1 M甘氨酸）的PBS处理细胞5分钟，用于淬灭过量的福尔马林；

可选步骤②：将含0.1% Triton X-100的PBS添加到固定细胞中，静置3-5分钟，以增加渗透性，然后用PBS洗涤细胞2-3次。

（5）取约100μl现配的染色工作液，使其完全覆盖盖玻片上的细胞，室温避光孵育30min。

注意:

①通常情况下4℃-37℃均适合用于染色。为了避免工作液的挥发，孵育过程中将盖玻片置于一密封的容器内；

②若有需要，此时可加入不同于AMCA荧光光谱的细胞核染色液。

（6）室温下使用PBS清洗细胞2-3次，30s/次。

（7）使用滤纸尽量吸干细胞表面液体，将盖玻片倒置在滴有一滴抗荧光淬灭剂的载玻片上，用纸巾轻轻吸掉多余淬灭剂，然后用透明指甲油密封盖玻片四周。将此法处理玻片置于4℃避光存放至少6个月仍能维持F-actin染色。

（8）荧光显微镜下观察染色结果，AMCA的最大激发光/发射光为350/450nm。

注意事项：

①  可在细胞培养板/共聚皿中对细胞进行染色，步骤（7）改为滴加抗荧光淬灭剂到孔内保护荧光；

②  鬼笔环肽染色不适用于甲醇或丙酮固定的细胞，这类固定剂会破坏肌动蛋白的结构，并阻止鬼笔环肽进行染色，推荐使用0.2%戊二醛固定细胞；

③  鬼笔环肽对pH值敏感：如果pH值升高，鬼笔环肽中关键的硫醚桥键会被裂解，从而失去对肌动蛋白的亲和力；

④  鬼笔环肽染色可以与抗体染色搭配使用，推荐在一抗或二抗孵育期间加入鬼笔环肽偶联物；

⑤  鬼笔环肽偶联物的最佳浓度和孵育时间取决于具体的细胞类型、固定/样本制备条件和/或细胞/组织对探针的通透性；

⑥  悬浮细胞可以附着在多聚-D-赖氨酸微孔板或盖玻片上，然后使用贴壁细胞方案进行染色；

⑦  如果细胞状态差，建议在染色液和洗涤液中加入血清（2-10%）；

⑧  在某些情况下，可以使用一步法快速进行鬼笔环肽染色：4℃下，在3.7% 福尔马林和50-100 µg/mL棕榈酰溶血磷脂酰胆碱与鬼笔环肽偶联物中孵育 20分钟，然后洗涤3次并封固；

⑨  在未固定的样本中进行染色时，鬼笔环肽的结合会降低肌动蛋白亚基与肌动蛋白丝末端的解离速率，从而通过防止肌动蛋白丝解聚来稳定肌动蛋白丝；

⑩  对于其他样本类型的染色流程，为优化固定条件，便于染色，建议在一定范围内变更固定时间和福尔马林浓度；

⑪ 鬼笔环肽可用于经福尔马林固定和透化的组织切片、细胞培养物等样本类型以及无细胞实验，也可用于已脱蜡的石蜡包埋样本，且鬼笔环肽染色不需要抗原修复；

⑫ 鬼笔环肽的半数致死量LD50为2 mg/kg，使用时请注意防护。但通常情况下，鬼笔环肽的用量很小，不会造成重大安全风险；

⑬ 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭；

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。