NHS-Biotin

本方案仅提供指导，应根据您的实际需求进行修改

一、准备材料：

1.可溶于水的有机溶剂，如二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF）。

2.磷酸盐缓冲盐水（PBS）或其他pH 7-8 的无胺缓冲液用作反应缓冲液。

3.用于缓冲液交换的脱盐柱或透析装置。

二、蛋白质生物素化标记方案：

通常反应时在每个蛋白质分子中会掺入3-5个生物素。抗体是一种很大的蛋白质，会在每个免疫球蛋白分子中标记8-12个生物素分子，特别是在使用摩尔过量的生物素试剂时。故实际使用过程中可调整生物素试剂与蛋白质的摩尔比，以获得所需的掺入水平。

A.计算：

每次反应使用的生物素试剂的量取决于要标记的蛋白质的量及其浓度。通过使用合适的生物素和蛋白质的摩尔比，可以控制标记的程度。当标记更稀薄的蛋白质溶液时，需要更大摩尔倍数的生物素才能达到同样的结果。为获得最佳效果，对于10mg/mL的蛋白质溶液，使用摩尔量为≥12倍的生物素；对于2mg/mL的蛋白质溶液，使用摩尔量为≥20倍的超量生物素。

1. 计算添加到反应中的生物素试剂的毫摩尔：

   

20=2mg/mL蛋白质样品中生物素的推荐摩尔倍数

1. 计算添加到反应中的10mM生物素试剂溶液的微升数：

   

B.生物素标记反应

1. 根据计算中的数量，将1-10mg蛋白质溶解在0.5-2.0mL PBS中。
2. 使用前，在有机溶剂（如DMSO）中制备10mM生物素试剂溶液。
3. 将适当体积（μL）的10mM生物素试剂溶液添加到蛋白质溶液中。
4. 将反应液在冰上孵育2小时或在室温下孵育30分钟。
5. 通过ELISA或Western blot检测标记蛋白。

三、细胞生物素化标记方案：

NHS-Biotin试剂可对悬浮细胞或培养板中的贴壁细胞进行标记。在贴壁细胞标记时，NHS-Biotin试剂在细胞所有表面的扩散将受到限制，并且标记将主要发生在暴露的表面上并穿过暴露的表面。且必须将培养基从细胞中洗掉，否则含胺成分将竞争并猝灭与细胞蛋白质的反应。最佳标记效果是使用更浓缩的细胞悬。一般来说，终浓度为2-5mM NHS-Biotin试剂是有效的。NHS-Biotin反应在pH值较高时发生得更快；因此，下面的例子中使用pH 8.0，以便尽快完成标记。

1. 用冰冷的PBS（pH 8.0）清洗细胞3次，去除细胞内含胺的培养液和蛋白质。

2. 在PBS（pH 8.0）中以~25×10⁶ cell/mL的浓度悬浮细胞。

3. 在二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF）等水溶性有机溶剂中加入4-5mg试剂，配制成20mM的NHS-Biotin试剂溶液。

4. 每1ml细胞悬液中加入100μL NHS-Biotin试剂溶液（得到~2mM的生物素试剂）。

5. 在室温下孵化反应混合物30分钟。注：可能需要更长的反应时间以确保NHS-Biotin试剂向细胞内的显著扩散；否则，大多数标记可能发生在细胞表面。

6. 使用含100mM甘氨酸的PBS清洗细胞三次，停止并除去多余的生物素试剂和副产物。

7. 根据研究方法检验或分析生物素标记的细胞。

四、 使用注意事项：

1. NHS-Biotin试剂对湿度敏感。如果试剂瓶已冷藏，请在打开前将试剂瓶完全平衡至室温，以避免容器内出现湿气凝结。
2. NHS酯会在水中迅速水解，故NHS-Biotin需现配现用；使用时仅称取和溶解少量试剂，并且不要制备储存溶液。

避免使用含有伯胺（例如Tris或甘氨酸）的缓冲液，因为它们会与NHS酯反应。如有必要，可进行透析或脱盐，将蛋白质样品交换至无胺缓冲液中，例如磷酸盐缓冲盐等。