本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1、制备染色液
（1）染料储存液:使用DMSO将MitoMark Red I溶解成1-5mM的储存液。配置好的储存液分装后于-20℃避光保存。
（2）染料工作液:用合适的缓冲液(如:无血清培养基，HBSS或PBS)稀释储存液，配制浓度为25-500 nM的MitoMark Red I工作液。
注意:
①MitoMark Red I常用的工作浓度范围是25-500nM，建议使用相对偏低浓度进行染色。若使用更高浓度可能会染上其他细胞结构，为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度；
②对于后续需要进行固定和透化的细胞染色，建议使用工作浓度范围在100-500nM；
③请根据实际情况调整及优化工作液浓度，现用现配。
2、细胞悬浮染色(以6孔板为例)
（1）悬浮细胞经1000g离心3-5min。弃去上清液，使用PBS清洗两次，每次5分钟。
（2）贴壁细胞使用PBS清洗两次，加入胰酶消化细胞，消化完成后经1000g离心3-5min。
（3）加入1mL染料工作液重悬细胞，室温避光孵育15-45min分钟，不同细胞最佳培养时间不同。
（4）孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除上清液，加入PBS清洗2-3次，每次5分钟。（5）使用无血清细胞培养基或PBS重悬细胞，通过荧光显微镜或流式细胞技术进行观察。
3、细胞贴壁染色
（1）在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。
（2）从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中。
（3）从盖玻片的一角加入100μL染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞，室温避光孵育15-45min分钟。
（4）吸弃染料工作液，使用培养液清洗盖玻片2~3次，每次5分钟。
4、使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察。MitoMark Red I的最大激发/发射波长578/599 nm。
注意事项：
① 若后续步骤如ICC需要透化，建议使用含表面活性剂（如Triton X-100）的缓冲液来透化细胞。细胞也可以用冰丙酮透化处理5min，之后用PBS清洗（即使后续细胞不用进行其它抗体标记，这一丙酮透化步骤也可能改善信噪比）；
②细胞如需固定染色，建议使用含2-4%多聚甲醛的新鲜配制预热的缓冲液或培养基进行固定；
③荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭；
④为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
References:
[1]. K Gilmore, M Wilson. The use of chloromethyl-X-rosamine (Mitotracker red) to measure loss of mitochondrial membrane potential in apoptotic cells is incompatible with cell fixation. 1999 Aug 1;36(4):355-8. doi: 10.1002/(sici)1097-0320(19990801)36:4<355::aid-cyto11>3.0.co;2-9.
