Lucigenin (NSC-151912)

使用Lucigenin测定活细胞氧化应激水平

本实验方案根据研究内容整理，仅供参考，请根据实际需求进行调整。

1. 制备染色液

(1) 配置储存液：使用DMSO溶解Lucigenin，配置浓度为10mM的储存液。

注意：未使用的储存液分装后应在-20℃或-80°C避光保存，避免反复冻融。

(2) 配置工作液：用合适的缓冲液（如：无血清细胞培养基或PBS）稀释储存液，配制浓度为5-10μM的工作液。

注意：请根据实际情况调整工作液浓度，建议现用现配。

2. 细胞悬浮染色

（1）悬浮细胞：在4°C下，以1000g离心3-5分钟，弃去上清液，用PBS清洗两次，每次5分钟。

（2）贴壁细胞：弃去细胞培养基，加入胰蛋白酶消化细胞以获得单细胞悬液。消化完成后，在4°C下以1000g离心3-5分钟，弃去上清液。用PBS清洗两次，每次5分钟。

（3）加入Lucigenin工作溶液重悬细胞，室温避光孵育15分钟。

（4）孵育结束后，在4°C下以400 g离心3-4分钟，去除上清液，加入PBS清洗2次，每次5分钟。

（5）用无血清细胞培养基或PBS重悬细胞，通过荧光显微镜或流式细胞术进行检测，荧光最大吸收/发射波长为Ex/Em=455/505nm。

3. 细胞贴壁染色

（1）在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。

（2）移去细胞培养基，用预温的PBS轻轻清洗细胞一次。

（3）加入适量的Lucigenin工作液，使其能覆盖所有细胞。

（4）室温避光孵育15分钟。

（5）孵育结束后，吸弃染料工作液，使用预温的PBS清洗盖玻片2~3次。

（6）可加入少量新鲜的无血清培养基或PBS覆盖细胞，立即进行检测。

（7）显微镜检测：Lucigenin检测超氧阴离子的化学发光信号，其荧光最大吸收/发射波长为Ex/Em=455/505nm。

注意事项：

（1）Lucigenin作为化学发光探针，其信号强度与超氧阴离子的产生速率和浓度直接相关。实验需设置严格的阴性和阳性对照。

（2）孵育和检测过程应注意避光操作，以减缓可能的荧光淬灭并降低背景。

（3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

References:

[1] Li Y, Zhu H, Kuppusamy P, et al. Validation of lucigenin (bis-N-methylacridinium) as a chemilumigenic probe for detecting superoxide anion radical production by enzymatic and cellular systems. J Biol Chem. 1998 Jan 23;273(4):2015-23.