C6 NBD Ceramide (d18:1/6:0)

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。

1.制备染色液

(1) 配置储存液: 将低温保存的C6 NBD Ceramide从冰箱取出，室温静置恢复至室温。低速离心，将粉末集中在试管底部。向管中添加无水DMSO溶解粉末，制备浓度为5-10 mM的储存液。

注意:未使用的储存液根据单次用量分装后在-20℃避光保存，避免反复冻融。

(2) 配置工作液: 使用HBSS/HEPES按照1:1000的比例稀释储存液，制备浓度为5-10μM的工作液。

注意:请根据实际情况调整工作液浓度，现用现配。

2. 活细胞高尔基体的荧光标记

(1) 在无菌盖玻片上培养贴壁细胞；

(2) 从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，去除细胞培养液，用合适的缓冲液（如HBSS/HEPES）洗涤生长在盖玻片上的细胞；

(3) 从盖玻片的一角加入约100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞，4℃避光孵育30分钟；

注意：不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索。

(4) 吸走染色液，用冰浴预冷的细胞培养基洗涤细胞2-3次，更换为新鲜培养液37℃再孵育30min；

(5) 用新鲜培养液再洗涤一次，随后用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到高尔基体呈明亮的强荧光染色，而细胞内的其他膜系统呈比较微弱的荧光染色。

3. 固定细胞高尔基体的荧光标记

(1) 在无菌盖玻片上培养贴壁细胞；

(2) 用HMEM冲洗盖玻片上的细胞。然后将细胞固定在戊二醛或多聚甲醛中5-10 min（25℃）；

(3) 使用戊二醛或多聚甲醛室温处理5-10 min，固定细胞；

注意：避免使用去垢剂和甲醇/丙酮固定剂处理细胞。

(4) 在平衡盐溶液（如HCMF）中洗涤固定的细胞；

(5) 将含有盖玻片的培养皿转移至冰水浴中，并与新鲜制备的NaBH₄孵育3-5 min（用于戊二醛固定的细胞）；

(6) 使用冰浴预冷的HCMF冲洗细胞2-3次，每次约10分钟；

(7) 恢复至室温，从盖玻片的一角加入约100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞，室温避光孵育60 min；

(8) 弃去染色液，使用HCMF清洗固定的细胞，并与10%胎牛血清或2 mg/mL BSA孵育（30-90min; 25℃（室温）），以从制备液中反交换过量的C6 NBD Ceramide，并增强高尔基体的染色。

4.显微镜检测：C6 NBD Ceramide的最大吸收光/发射光波长为466/536nm。

注意事项：

①  C6 NBD Ceramide适用于固定细胞染色，而BODIPY FL C5-Ceramide（目录号 : GC68793）和BODIPYTR-ceramide不适合。

②  荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

③  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

References:

[1].Pagano RE. A fluorescent derivative of ceramide: physical properties and use in studying the Golgi apparatus of animal cells. Methods Cell Biol. 1989;29:75-85.