本方案来自文献，请根据您的具体需求修改。
一、酵母液泡的BODIPY-C12 Ceramide染色[1]
1. 配置染色储备液：使用氯仿：甲醇（19：1；v/v）混合液溶解BODIPY-C12 Ceramide，浓度为1mg/ml。将50μL贮备液转移至玻璃管中，并在氮气流下干燥至少2小时。将干燥的BODIPY-C12 Ceramide膜重悬于200μL无水乙醇中，转移至微量离心管中并避光储存。
2. 取1mL酵母培养物（0.4%葡萄糖（w/v）基本培养基）收集到1.5mL无菌微量离心管中，3000g离心1分钟。
3. 转移上清液至单独的试管中，加入10μL 34mg/mL BSA（0.4%葡萄糖（w/v）基本培养基）混合并涡旋，再加入20μL BODIPY-C12 Ceramide储备液并再次涡旋以生成BSA-BODIPY-C12 Ceramide工作液（通常浓度为1-10μM）。
4. 工作液加回酵母细胞重悬，30℃孵育1小时。
5. 孵育结束后，3000g离心1分钟，加入无菌MilliQ水清洗3次。
用剩余酵母细胞培养物的上清液重悬细胞，通过荧光显微镜观察：激发/发射最大值分别为505/540nm。
二、活细胞的BODIPY-C12 Ceramide染色[2-3]
1. 配置BSA-BODIPY-C12 Ceramide复合染色液：
(1) 使用氯仿：甲醇（19：1；v/v）混合液溶解BODIPY-C12 Ceramide，浓度为1mM。将50μL贮备液转移至玻璃管中，并在氮气流下干燥至少2小时。将干燥的BODIPY-C12 Ceramide膜重悬于200μL无水乙醇中，转移至微量离心管中并避光储存。
(2) 用10mL不含血清的平衡盐溶液（HBSS/HEPES）或培养基配置0.34mg/mL的BSA溶液，加入200μL BODIPY-C12 Ceramide母液，涡旋搅拌，获得BSA-BODIPY-C12 Ceramide复合工作液（5μM BODIPY-C12 Ceramide+5μM BSA；浓度通常为1-10μM）。
2. 活细胞贴壁染色
(1) 在无菌盖玻片上培养细胞。
(2) 吸去培养皿中的培养基，用HBSS/HEPES冲洗含细胞的盖玻片3次。
(3) 从盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
(4) 4°C或者37°C避光孵育10-30min，吸弃染色液，用HBSS/HEPES清洗2-3次。
(5) 加入新鲜染色液，再次37°C避光孵育10-30min，吸弃染色液，用HBSS/HEPES清洗。
(6) 用无血清细胞培养基或HBSS/HEPES孵育细胞，通过荧光显微镜观察：激发/发射最大值分别为505/540nm。
注意：BODIPY-C12 Ceramide活细胞染色采用“先孵育后换液再孵育”两步法：
①“4°C+37°C”模式：4°C孵育使染料锚定在细胞膜上；换液清除未结合染料；37°C孵育重启细胞活动，细胞内吞染料，用于追踪染料在细胞内的转运路径。该模式要注意细胞对低温的耐受，注意细胞活性。
②“37°C+37°C”模式：37°C孵育使细胞内吞染料；换液清除未结合探针、降低背景；37°C孵育使染料进一步富集，用于获得更强的染色信号。
注意事项：
1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
References:
[1] Kim H, Lipp NF, Juarez-Contreras I, Wong AM, Budin I. Transport of sphingolipids by yeast Npc2 supports phase separation of the vacuole membrane. Preprint. bioRxiv. 2025;2025.09.14.676161. Published 2025 Sep 17.
[2] Celis JE, ed. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 2nd ed. Vol 2. Academic Press; 1998:507-512.
[3] Chazotte B. Labeling the Golgi Apparatus with BODIPY-FL-Ceramide (C5-DMB-ceramide) for Imaging. CSH Protoc. 2008;2008:pdb.prot4931.
