Biocytin

Biocytin全细胞记录示踪法

本实验方案根据研究内容整理，仅供参考，请根据实际需求进行调整。

（1）试剂与电极准备：配制含0.1% Biocytin的细胞内液（成分：110mM K-葡萄糖酸盐、10mM NaCl、1mM MgCl₂、10mM EGTA、40mM HEPES、2mM Mg-ATP、0.3mM Na-GTP，pH=7.3，渗透压280-300mOsm）。根据目标神经元大小控制玻璃电极电阻（中型多棘神经元：6-8MΩ；椎体神经元/小白蛋白中间神经元：5-6MΩ），电极尖端需无气泡。

（2）脑片制备与神经元定位：取3月龄小鼠脑组织，用振动切片机制备含初级运动皮层（M1）或纹状体的冠状切片（厚度320μm）。切片在含氧人工脑脊液（aCSF）中恢复1小时后，置于恒温灌流记录槽（30°C）。通过红外微分干涉对比（IR-DIC）显微镜识别神经元形态（椎体神经元呈泪滴形，中型多棘神经元呈椭圆形）。

（3）全细胞记录与生物胞素加载：电极接触细胞膜后施加负压形成吉欧封接，短时强吸破膜建立全细胞模式。在电流钳模式下记录动作电位（AP），随后维持全细胞模式40-60分钟，使生物胞素充分扩散至神经元树突、轴突等精细结构。缓慢撤出电极使细胞膜重密封。

（4）组织固定与荧光显色：记录后的脑片用4%多聚甲醛4°C固定24小时，经1% Triton-X100透化后，与链霉亲和素-Alexa 594（红色）或Alexa 488（绿色）荧光等探针（1:1000稀释）4°C孵育24小时。

（5）形态学成像与分析：通过共聚焦显微镜（63×油镜）在相对应的荧光信号下，采集神经元Z轴层扫图像（层间距0.2μm）。使用ImageJ软件进行三维重建，分析树突总长度、分支复杂度（Sholl分析）及树突棘密度（单位长度树突上的棘数量）。

注意事项：

（1）实验需遵循动物伦理规范。

（2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

References:

[1] Tan S, Mo X, Qin H, et al. Biocytin-Labeling in Whole-Cell Recording: Electrophysiological and Morphological Properties of Pyramidal Neurons in CYLD-Deficient Mice. Molecules. 2023 May 15;28(10):4092.