TO-PRO 1

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1、配制工作液: 使用合适的缓冲液（如HHBS或PBS）稀释浓度为5 mM的TO-PRO 1贮存液，配置成1-5μM的工作液。
注意:
①首次使用储存液时建议根据单次用量分装成小规格，-20℃或-80℃避光冻存，避免反复冻融；
②建议初次实验时设置染色液浓度梯度，以确定最佳工作浓度；
③高染料浓度可能引起其它细胞结构的非特异染色；
④请根据实际情况调整工作液浓度，现用现配。
2、细胞染色（以6孔板为例）
2.1细胞悬浮染色
（1）悬浮细胞经1000g离心3-5min。弃去上清液，使用PBS清洗两次，每次5分钟。
（2）贴壁细胞使用PBS清洗两次，加入胰酶消化细胞，消化完成后经1000g离心3-5min。
（3）加入1mL经37 °C预热的TO-PRO 1染料工作液重悬细胞，37 °C避光孵育15-60min分钟，不同细胞最佳培养时间不同。
（4）孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除上清液，加入PBS清洗2-3次。
（5）使用缓冲液重悬细胞，通过荧光显微镜或流式细胞技术进行观察。
2.2细胞贴壁染色
（1）在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。
（2）从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中。
（3）从盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞，37 °C避光孵育15-60min分钟。
（4）吸弃染料工作液，使用培养液洗盖玻片2~3次，通过荧光显微镜进行观察。
3.显微镜检测：TO-PRO 1结合核酸后的最大激发/发射光为515/531 nm

注意事项：
1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
References:
[1]. Elena Gorokhova, Lisa Mattsson, Annica M Sundström. A comparison of TO-PRO-1 iodide and 5-CFDA-AM staining methods for assessing viability of planktonic algae with epifluorescence microscopy. 2012 Jun;89(3):216-21. doi: 10.1016/j.mimet.2012.03.005. Epub 2012 Mar 14.