Rhodamine B hydrazide

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。

1. 制备染色液

(1)配置储存液:使用DMSO溶解Rhodamine B hydrazide，配置浓度为5-10mM的储存液。

注意:未使用的储存液分装后在-20℃或-80℃避光保存，避免反复冻融。

(2)配置工作液:用合适的缓冲液(如:无血清培养基或PBS)稀释储存液，配制浓度为5-10μM的工作液。

注意:请根据实际情况调整工作液浓度，现用现配。

2. 细胞悬浮染色

(1)悬浮细胞：经4℃、1000g离心3-5分钟，弃去上清液，用PBS清洗两次，每次5分钟。

(2)贴壁细胞：使用PBS清洗两次，加入胰酶消化细胞，消化完成后经1000g离心3-5min。

(3)加入Rhodamine B hydrazide工作溶液重悬细胞，37℃避光孵育2h。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索。

(4)孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除上清液，加入PBS清洗2-3次，每次5分钟。

(5)用预温的无血清细胞培养基或PBS重悬细胞，通过荧光显微镜或流式细胞术观察。

3. 细胞贴壁染色

(1)在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。

(2)从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中。

(3)从盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。

(4) 37℃避光孵育2h。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索。

(5)孵育结束后吸弃染料工作液，使用预温的培养液清洗盖玻片2~3次。

4. 检测胞内产生的一氧化氮

(1) 将细胞与5μM Rhodamine B hydrazide（2.5%，v/v DMSO）于37℃避光孵育4小时；

(2) 弃去染液，使用PBS清洗两次；

(3) 将细胞与与含有375μM SNAP（S-nitroso-N-acetyl-D,L-penicillamine，一种NO释放剂）的DMEM于37℃避光孵育2小时；

(4) 使用PBS清洗两次，然后将样本浸泡于PBS中。

5. 显微镜检测：Rhodamine B hydrazide的最大激发波长和发射波长分别为546/610nm。

注意事项：

1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

References:

[1]. Chi-Ming Wu,et,al. Sensitivity evaluation of rhodamine B hydrazide towards nitric oxide and its application for macrophage cells imaging. 2011 Dec 5;708(1-2):141-8. doi: 10.1016/j.aca.2011.10.005. Epub 2011 Oct 8.