Pyronin Y (Pyronine G)

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1、制备Pyronin Y染色液
(1) 配制Pyronin Y染料储存液: 使用DMSO/无菌水溶解固体粉末，配置成1-5mM的Pyronin Y染料储存液。
注意: 使用无菌水配置的储存液需使用0.22μm滤膜过滤。Pyronin Y储存液建议分装后于-20℃避光保存，避免反复冻融。
(2)工作液制备:使用合适的缓冲液(如HBSS或PBS)稀释储存液，配制浓度为1-5μM的Pyronin Y工作液。
注意: 请根据实际情况调整Pyronin Y工作液浓度，现用现配。
2、细胞染色
2.1 悬浮细胞（以6孔板为例）
(1)悬浮细胞经1000g离心3-5min。弃去上清液，使用PBS清洗两次，每次5分钟。
(2)加入1mL的Pyronin Y染料工作液，室温避光孵育1-5min分钟。不同的细胞最佳培养时间不同。
(3)孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除上清液，加入PBS清洗2-3次，每次5分钟。
(4)使用无血清细胞培养基或PBS重悬细胞，通过荧光显微镜或流式细胞技术进行观察。
2.2 贴壁细胞
(1)在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。
(2)从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中。
(3)从盖玻片的一角加入100μL的Pyronin Y染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞，室温避光孵育1-5min分钟。
(4)吸弃染料工作液，使用培养液洗盖玻片2~3次，通过荧光显微镜进行观察。
3.显微镜检测：Pyronin Y的最大激发光为540-550nm，最大发射光为560-580nm。

注意事项：
①Pyronin Y适用于石蜡切片染色，建议在PBS中配置5%的Pyronin Y染色工作液，室温避光孵育5-10min；
荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭；
②荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭；
③为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
References:
[1]. Taro Mannen, Tetsuro Hirose. RNase Sensitivity Screening for Nuclear Bodies with RNA Scaffolds in Mammalian Cells. 2017 Apr 20;7(8):e2232. doi: 10.21769/BioProtoc.2232.
[2]. Bo Li, Ying Wu, Xiao-Ming Gao. Pyronin Y as a fluorescent stain for paraffin sections. 2002 Jun-Jul;34(6-7):299-303. doi: 10.1023/a:1023325213198.