产品特性
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项目
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特性
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磁珠浓度
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10mg/mL
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磁珠粒径
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200nm
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IgG结合量
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0.7mg/mL
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适用范围
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IP , Co-IP , CHIP
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适用抗体种属
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广谱抗体种属
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推荐缓冲液 (自备)
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结合/洗涤缓冲液
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PBST : 1× PBS + 0.5% Tween-20, pH 7.4
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洗脱缓冲液
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0.15M Glycine, pH 2.5-3.1
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操作步骤
1.抗原样品制备
(1)血清若目标蛋白丰度较高，建议稀释血清样品至目标蛋白终 浓度为10-100μg/mL，置于冰上备用 (或置于-20°C长期保存) 。
(2)悬浮细胞离心收集细胞 (4°C, 500 g, 10min)，弃上清后称重，按照每毫克细胞50 μL的比例用1×PBS (pH 7.4)洗涤2次；按照每毫克细胞5-10μL的比例加入细胞裂解缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10min；离心 (4°C, 14000g, 10min) ，收集上清液，置于冰上备用 (或置于-20°C长期保存) 。
(3)贴壁细胞移去培养基，按照每1×105的细胞150μL的比例用1×PBS (pH 7.4)洗涤2次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5mL EP管内，按照每1×105的细胞20-30μL的比例加入细胞裂 解缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10min；离心 (4°C, 14000g, 10min) ，收集上清液，置于冰上备用 (或置于-20°C长期保存)。
(4)大肠杆菌离心大肠杆菌 (4°C, 12000g, 2min)，弃上清后称重，按每克 (湿重)菌体10mL的比例用1×PBS (pH 7.4)洗涤2次；按每克(湿重)菌体5-10mL 的比例加入细胞裂解缓冲液 (RIPA细胞裂解缓冲液)，同时加入蛋白酶抑制剂，重悬菌体，超声裂解细胞，离心 (4°C, 17000g, 10min)，收集上清液，置于冰上备用 (或置于-20°C长期保存)。
2. 磁珠预处理
将磁珠充分混悬，取25-50μL磁珠，置于1.5mL EP管中，加入400μL结合/洗涤缓冲液，充分混悬, 置于磁力架，磁性分离，弃上清；重复以上洗涤步骤2次。
3. 抗体与磁珠结合
(1) 抗体预处理：使用结合/洗涤缓冲液将抗体稀释至终浓度为5-50μg/mL。
(2) 抗体-磁珠结合：将稀释好的400μL抗体加入步骤2处理好的磁珠中，充分混悬，置于翻转混合仪孵育 (室温，30min；4°C，2h)，磁性分离，收集磁珠，上清液收集于新的EP管中，以备后续使用。
(3) 洗涤：加入400μL结合/洗涤缓冲液，充分混悬磁珠，磁性分离，弃上清；重复洗涤4次。
注：结合过程中，磁珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象，不会影响实验结果。
4. 抗原与抗体-磁珠复合物结合
(1) 抗原-抗体-磁珠复合物结合：加入400μL步骤1准备的抗原样品，充分混悬，置于翻转混合仪孵育 (室温，30min；4°C，2h) ，磁性分离，弃上清。
(2) 洗涤：使用400μL结合/洗涤缓冲液充分重悬磁珠，磁性分离，弃上清；重复洗涤 4 次。
5. 抗原洗脱 （下列两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法）
a. 变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。步骤：分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入25-50μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，95°C加热5min。分离磁珠，收集上清，进行SDS-PAGE检测。
b. 非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。步骤：分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入25-50μL洗脱缓冲液，室温孵育10min；分离磁珠，收集上清至新的EP管，并立即滴入总体积1/10体积的中和缓冲液 (0.1M NaOH)，将洗脱产物pH调节至中性，样品用于后期功能分析。
注：本步骤洗脱的抗原为抗原-抗体复合物，如操作者需要单独洗脱目标抗原，推荐使用交联剂，并按相关实验说明操作。
6. 注意事项
(1) 本产品pH值为6-8，禁止冻结。
(2) 本产品应避免离心、干燥或冻存，禁止长时间置于磁场，可能会引起磁珠聚团，抗体结合后操作过程应轻柔，避免抗体脱落。
(3) 为最大限度的降低蛋白质降解，请配合使用GLPBIO蛋白酶抑制剂 (GLPBIO 产品目录号：GK10022，GK10019)。
(4) 为提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性，可以先将抗体与样品进行孵育， 形成抗体-抗原复合物，再用Protein A/G磁珠捕获复合物。
(5) 磁珠在低pH的洗脱缓冲液中发生聚集属于正常现象。在结合/洗涤缓冲液 和洗脱缓冲液中添加终浓度为0.1 % (v/v)的非离子型去垢剂 (如NP-40、 Tween-20或Triton X-100) 可有效防止磁珠聚集。经过低pH洗脱操作的磁珠 可以用结合/洗涤缓冲液洗涤至中性，然后用含有0.1 % (v/v) Tween-20的Tris Buffer (pH 7.5)振荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理2min，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。
(6) 超声处理会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落，所以磁珠在捕获抗体后不宜使用该方法重悬磁珠。
