PKH 67 Cell Membrane Labeling Kit

本方案仅供参考，请根据您的具体需求进行修改。
1.染色液配制：
（1）在首次使用前，从冰箱中取出试剂，静置几分钟恢复至室温。对Solution A（PKH67 stock solution）的管子进行短暂离心，将试剂充分集中在管底。
注意：Solution A极易降解，建议根据单次用量对Solution A进行分装，-20或-80℃避光保存，避免反复冻融。
（2）根据待测细胞样本数量，用Solution B将Solution A稀释10倍，再用合适的溶液（如无血清培养基、HBSS或PBS）稀释25倍，配制成染色工作液，现配现用。
注意：建议根据不同细胞及实验体系调整最佳工作液浓度。常用方案是将Solution A稀释250倍使用，部分细胞可能需要适当增加浓度。
2. 细胞染色
（1）在1.5ml锥底聚丙烯离心管中制备单细胞悬液，用无血清培养基清洗细胞一次。
（2）400×g离心细胞5min，得到松散的细胞沉淀。
（3）轻柔吸弃上清，注意不要吸到细胞。
（4）使用约100μl染色工作液充分重悬细胞，建议工作液中细胞浓度约为10⁷/ml。
（5）2～8℃孵育15～30分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。
注意：
① 建议先在37℃孵育5min，再转移至4℃孵育15min。低温孵育可降低细胞对染料的内吞作用，有助于染料对细胞膜的标记，并且降低染料定位细胞质囊泡的可能性。
② 建议在染色过程中重悬细胞2~3次，有助于染料充分标记样品。
（6）20~25℃、400×g离心细胞10min，轻柔吸弃上清，然后使用PBS或无血清培养基清洗细胞2-2次，以确保完全去除未结合染料。
（7）通过流式细胞仪检测标记细胞，Ex/Em=490/502nm

注意事项
1、荧光染料均存在淬灭问题，实验过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。