Phallacidin

Phallacidin用于荧光标记F-肌动蛋白细胞骨架的实验方案^[1]

本实验方案根据研究内容整理，仅供参考，请根据实际需求进行调整。

1.试剂准备：

（1）Phallacidin合成NBD-Phallacidin：通过Phallacidin与乙二胺反应将其转化为酰胺。含有一级胺的该衍生物随后与4-氯-7-硝基苯-2-恶唑-1,3-二唑(NBD-Cl)在无水甲醇中混合。随后反应生成荧光衍生物NBD-Phallacidin。通过醚沉淀法对标记和未标记的Phallacidin进行部分纯化。

（2）NBD-Phallacidin 储备液：将经SP-Sephadex色谱纯化的NBD-Phallacidin溶于适当的缓冲液（如磷酸盐缓冲液或Hanks‘平衡盐溶液）或细胞培养基中，配制成工作液。用于固定细胞染色的部分纯化制品中NBD-Phallacidin含量约为20%，工作浓度约为0.9-1.7μg/mL。用于活细胞染色的纯化NBD- Phallacidin工作浓度约为14-57ng/mL或5.7-8.6μg/mL。

（3）缓冲液与培养基：磷酸盐缓冲盐水（PBS）；Hanks‘平衡盐溶液（HBSS）；高葡萄糖缓冲液A（120mM NaCl，15mM 葡萄糖，10mM Hepes，4.4mM NaHCO₃，3mM KCl，1mM Na₂PO₄，pH 7.1）；Dulbecco改良Eagle培养基（含10%胎牛血清）。

2.细胞固定与染色：

（1）细胞固定：将生长于盖玻片上的细胞在22°C下用2%甲醛（溶于PBS）固定20分钟。

（2）透化处理：用PBS洗涤两次后，用预冷的丙酮（-20°C）提取7-10分钟，然后空气干燥。

（3）染色：在盖玻片上加入350μL含有0.3-0.6μg NBD-Phallacidin的PBS或HBSS，染色5-30分钟。

（4）洗涤与观察：用4°C缓冲液洗涤四次以去除未结合毒素，随后进行荧光显微观察。

3.活体动物细胞染色流程

（1）细胞透化：采用溶血卵磷脂透化法。用含14-40μg/mL棕榈酰溶血卵磷脂的高葡萄糖缓冲液A处理细胞2分钟。

（2）缓冲液体系：用高葡萄糖缓冲液A洗涤细胞四次以去除溶血卵磷脂。加入350μL含5ng NBD-Phallacidin的缓冲液A，室温染色5分钟。染色后用缓冲液A洗涤三次，在1小时内观察。

（3）培养基体系：用高葡萄糖缓冲液A洗涤细胞一次。加入含2-3μg NBD-Phallacidin的Dulbecco改良培养基（含10%胎牛血清），在37°C孵箱中染色5分钟。随后将细胞转移至预热的完全培养基中继续培养。

（4）活力检测：可使用荧光素二乙酸酯染色法评估细胞膜完整性和活力。

注意事项：

（1）该方法可用于标记多种已知的F-肌动蛋白结构，包括应力纤维、皱褶缘、细胞穹顶、与膜相关的弥散性肌动蛋白以及藻类中的肌动蛋白电缆。细胞核不被染色。

（2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

References:

[1] Barak LS, Yocum RR, Nothnagel EA, et al. Fluorescence staining of the actin cytoskeleton in living cells with 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole-phallacidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Feb;77(2):980-4.