PFB-FDGlu

PFB-FDGlu法测定人单核细胞中葡糖脑苷脂酶活性

本实验方案根据研究内容整理，仅供参考，请根据实际需求进行调整。

（1）试剂准备：将PFB-FDGlu溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成37.5mmol/L的储备液（5mg PFB-FDGlu溶于154µl DMSO），分装后于-20°C保存，建议一周内使用；将CBE（Conduritol B-epoxide）溶解于DMSO中，配制成50mM的储备液（5mg CBE溶于616.9µl DMSO），分装后于-20°C保存；配制含5%胎牛血清（FBS）、1mM EDTA和25mM HEPES的FACS缓冲液，过滤除菌后于4°C保存；使用RPMI 1640培养基（含10% FBS、1%青霉素-链霉素和1% L-谷氨酰胺）作为细胞培养液。

（2）细胞分离与准备：采集人外周血至BD CPT抗凝管中，室温下以1800×g离心20分钟，收集外周血单核细胞（PBMC）层。用DPBS洗涤细胞一次（300×g，15分钟），重悬于预热的培养液中，进行细胞计数，调整细胞浓度至1×10⁶个/管，分装至三个1.5ml离心管中（分别为CBE抑制组、DMSO对照组和同型对照管）。

（3）酶抑制与底物孵育：向CBE抑制管中加入2µl 50mM CBE储备液（终浓度1mM），向DMSO对照组中加入2µl DMSO，轻轻涡旋混匀，于37°C、5% CO₂培养箱中孵育60分钟。随后，向CBE抑制管和DMSO对照组中各加入2µl 37.5mM PFB-FDGlu储备液（终浓度0.75mM），轻轻涡旋混匀，继续于37°C、5% CO₂培养箱中孵育30分钟。

（4）反应终止与表面标记染色：孵育结束后，立即加入1ml预冷的FACS缓冲液终止反应，于4°C、300×g离心5分钟，弃上清。用95µl预冷FACS缓冲液重悬细胞，加入5µl抗人CD14-PE-Cy7抗体（CBE抑制管和DMSO对照组）或同型对照抗体（同型对照管），轻轻涡旋混匀，于4°C避光孵育20分钟。加入1ml FACS缓冲液洗涤细胞，离心后弃上清，用350µl FACS缓冲液重悬细胞，经细胞筛网过滤至流式细胞仪专用管中，于4°C避光保存，待测。

（5）流式细胞术检测与数据分析：使用配备488nm激光器和530nm-FITC滤光片（FL1通道）的流式细胞仪采集数据。

注意事项：

（1）该方法适用于新鲜分离或冻存复苏后的PBMC（冻存细胞需复苏后恢复培养约2小时）。

（2）重溶后的PFB-FDGlu性能会随储存时间延长而下降，建议在一周内使用。

（3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

References:

[1] Hughes LP, Halliday GM, Dzamko N. Flow Cytometry Measurement of Glucocerebrosidase Activity in Human Monocytes. Bio Protoc. 2020 Apr 5;10(7):e3572.