Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit (细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒)

1. 准备溶液：
试剂盒中的四种试剂室温复温，溶解后立即混匀置于冰上。取适当量的细胞质蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，现配现用，使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂C备用，在使用前数分钟内加入PMSF，现配现用，使PMSF的最终浓度为1mM。

2. 贴壁细胞：
用PBS洗一遍，用细胞刮刀收集细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞松散，并用移液器将细胞吹打下来。离心收集细胞，弃尽上清。
尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

3. 悬浮细胞：
用PBS清洗细胞，离心收集细胞，离心收集细胞，弃尽上清。

4. 每20μL细胞沉淀加入200μL添加了PMSF的细胞质蛋白抽提试剂A。(对于2*10⁶个HeLa细胞，其细胞沉淀的体积大约为20μL或40mg。)

5. 剧烈涡旋5-10秒，避免有细胞团块。

6. 冰浴10-15分钟。

7. 加入细胞质蛋白抽提试剂B 10μL。剧烈涡旋5秒，冰浴1分钟。

8. 剧烈涡旋 5秒，4℃ 12,000g离心5分钟。

9. 立即将上清转移至新的EP管中，即得到细胞质蛋白。如无需立即使用，可以-70℃冻存。(千万不要触碰沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。每2*10⁶个细胞用200μL细胞质蛋白抽提试剂A裂解后的上清中，其细胞质蛋白浓度约为2-5mg/ml，不同细胞有所不同。)

10. 管内的细胞核沉淀需要完全吸尽残余的上清，加入50μL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂C。(如果没有吸尽上清会带来细胞质蛋白的污染。)

11. 剧烈涡旋 15-30秒，充分混匀沉淀。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再剧烈涡旋 15-30秒，共30分钟。

12. 12,000g，4℃，离心10分钟。

13. 立即将上清转移至新的预冷EP管中，即得到细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。每2*10⁶个细胞用50μL本产品中的细胞核蛋白抽提试剂C裂解后获得的上清，其细胞核蛋白浓度约为1.2-3.0mg/ml，不同细胞有所不同。

14. 对于新鲜组织：
a. 将组织样品剪成尽可能小的块状。按照20:1的比例混合适当量的细胞质蛋白抽提试剂A和B(例如200μL细胞质蛋白抽提试剂A中加入10μL细胞质蛋白抽提试剂B)。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200μL组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液(对于不超过30mg的组织样品，仅需加入100μL组织匀浆液)，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。
b. 匀浆后把匀浆液转移到EP管内，冰浴静置15分钟。
c. 4℃ 1,500g离心5分钟。把上清转移至新的预冷EP管中，为抽提得到的部分细胞质蛋白。(千万不要触碰沉淀)
d. 得到的沉淀中很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤4开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤4至步骤13抽提得到细胞质蛋白和细胞核蛋白。
特别说明：对于起始量为30-60mg的组织样品，后续直接按照步骤4-13操作即可；对于起始量不超过30mg的组织样品，后续步骤4-13中的溶液的用量须减半使用。
抽提得到的细胞质蛋白可以和步骤14c中抽提得到的细胞质蛋白合并。新鲜的肝脏组织裂解后得到的蛋白溶液，其细胞质蛋白浓度约为3-10mg/ml，细胞核蛋白浓度约为3-10mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。

15.注意事项：
a. PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。
b. 抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
c. 本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。
d. 使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。