Nitrocefin

本方案仅提供实验指导。实际应用需根据您的研究目标、样本类型和检测平台进行优化和调整 ^[1-2]。
1. 试剂和材料准备
Nitrocefin、DMSO、PBS、菌落、菌悬液或裂解细胞样本、水解缓冲液。
2. 头孢硝芬溶液的制备
（1）储备液（1-10mg/mL）：将5-10mg Nitrocefin溶于DMSO中，充分混匀，避光保存，并在-20℃下保存数月。
（2）工作液（0.5-1.0mg/mL）：将储备液用PBS或检测缓冲液稀释至0.5-1.0mg/mL。如果制备后溶液呈红色（而非黄色），则表示浓度过高，应进一步稀释至黄色溶液。工作液应避光保存，-20℃保存，并在14天或2个月内使用。
3. β-内酰胺酶活性快速检测方法
（1）玻片法：在干净的玻片上滴加1滴工作液，接种单个菌落，观察其是否呈红色（20-30分钟内）。
（2）直接接触法：将工作液滴于菌落上，20-30分钟内观察其颜色是否变为红色。
（3）菌液法：在1mL菌液中加入3-5滴工作液，20-30分钟内颜色变为红色，为阳性结果。
（4）细胞裂解法：取1mL菌液，超声裂解后，加入3-5滴工作液，40分钟内颜色变为红色，为β-内酰胺酶活性。
4. 光度定量检测
（1）标准溶液及反应体系：以Nitrocefin和水解缓冲液+DMSO配制标准溶液及标准梯度。
（2）样品处理：将固体菌株离心、重悬、超声裂解后，取上清液进行测定。反应混合物：将样品+反应混合物（例如，测定缓冲液+Nitrocefin）加入到每个孔中。
（3）读数与计算：在490nm处进行动力学读数。建议每分钟读数一次，持续30-60分钟。根据标准曲线和时间变化计算β-内酰胺酶活力。
（4）单位定义为每分钟水解1µmol Nitrocefin所需的酶量。
操作注意事项
（1）操作过程中避免光照，以防止药物降解。
（2）为保持黄色配方的准确性，请勿在工作液变红前使用。
（3）应针对每种样品类型通过梯度浓度和时间优化实验条件。

References:

[1]. Shannon K, Phillips I. ?-Lactamase detection by three simple methods: Intralactam, nitrocefin and acidimetric[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1980, 6(5): 617-621.

[2]. Allen C, Turner C, Kalsi S, et al. Development of a rapid phenotypic test on a microfluidic device for carbapenemase detection using the chromogenic compound nitrocefin[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2020, 96(4): 114926.