I. NBD-Pen用于DEN诱导大鼠肝脏脂质自由基的检测
1. 向8周龄F344雄性大鼠腹腔注射单次剂量的二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine, DEN），剂量为100mg/kg体重。
2. 在DEN给药后（1、6或24h），使用盐酸美托咪定、咪达唑仑和布托啡诺混合溶液对8周龄F344雄性大鼠进行麻醉。
3. 将麻醉后的大鼠通过静脉注射给予2mM NBD-Pen（1mL/kg体重），溶于50%聚乙二醇300（PEG300）中。
4. NBD-Pen荧光值检测。
4.1 通过过量麻醉处死动物后，取出肝脏，用Potter型匀浆器在三倍体积（w/v）的冰冷1.15% KCl溶液中进行匀浆。
4.2 使用BCA蛋白定量试剂盒（Cat.No.: GK10009）测定肝匀浆和血清样品中的蛋白含量。
4.3 按照Bligh & Dyer[2]方法从肝脏和血清样品中提取脂质溶液，并使用荧光酶标仪测定NBD-Pen的荧光强度（λex/λem = 470/530nm）。
5. 肝组织切片的荧光成像。
5.1 将大鼠肝脏制备的冰冻组织切片用DAPI Fluoromount-G抗淬灭封片剂（Cat.No.: GB30154）封片于载玻片上。
5.2 使用BIOREVO BZ-9000显微镜，并配备GFP-BP滤光片（λex = 470/40nm，λem = 535/50nm）对每个切片中的NBD-Pen荧光进行观察。
II. NBD-Pen用于细胞中脂质自由基的检测
1.1 储备液的制备
使用无水DMSO配制10mM NBD-Pen储备液。
1.2 工作液的制备
使用预热的无血清细胞培养基或PBS将储备液稀释，制备10μM NBD-Pen工作液。
Note: 请根据实际情况调整NBD-Pen工作液的浓度，并在使用前现配。
光谱学方法
2.1 使用100mM磷酸缓冲液和0.5%乙醇制备脂质（500μM）乳液。
2.2 将该乳液与含0.5%乙腈的磷酸缓冲液中的5μM NBD-Pen混合。
2.3 向混合体系中加入指定浓度的LOX，并进行孵育。
2.4 进行荧光发射和ESR测定。
2.5 在激发和发射波长分别为470nm和530nm的条件下测定探针的荧光光谱。
2.6 使用X波段（9.45 GHz）ESR谱仪进行监测。
3. 细胞的制备与染色
3.1 弃去细胞培养基，用PBS和含10% FBS的无酚红培养基各洗涤细胞三次。
3.2 加入1μM NBD-Pen并孵育10min。
3.3 加入30mM二乙基亚硝胺（DEN）。
3.4 在37°C、5% CO₂湿润空气条件下立即进行荧光成像。
3.5 加入Hoechst33342（1μM）和SKF525A（50μM），孵育1h后，用PBS洗涤。
3.6 使用配有63×或40×物镜的共聚焦激光扫描显微镜进行荧光成像。
3.7 使用以下检测参数：
Hoechst33342，λex = 405 nm，λem = 410-505 nm；
NBD-Pen，λex = 458 nm，λem = 490-674 nm。
References:
[1]. Yamada, Ki., Mito, F., Matsuoka, Y. et al. Fluorescence probes to detect lipid-derived radicals. Nat Chem Biol 12, 608–613 (2016).
[2]. Bligh, E.G. & Dyer, W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911–917 (1959).
