操作指南
1.将 Calcein-AM 溶液和 PI 溶液置于室温进行解冻。
将 5μL Calcein-AM 溶液（2 mM）和 15μL PI 溶液（1.5 mM）加入 5 mL PBS 中，充分混合。 在这种情况下，Calcein-AM 的工作浓度为 2μM，PI 为 4.5μM。
由于各种细胞系的最佳染色条件不同，因此建议在初始实验中进行梯度浓度筛选。原则上使 用最低的探针浓度以获得最佳的荧光结果。
由于 Calcein-AM 在水溶液中的稳定性很差，因此只能在每次实验之前制备染色液，并在一 天之内使用。
注意：PI 具有高度的致癌性和致突变性，因此在操作时应戴手套，安全护目镜和面罩。如 果它与您的皮肤接触，请立即用大量自来水清洗。
2. 对于贴壁细胞，用胰蛋白酶消化细胞，然后通过离心（1000 rpm，3 分钟）收集细胞。
对于悬浮的细胞，通过离心（1000 rpm，3 分钟）收集细胞。
3. 用 PBS 洗涤细胞 2-3 次以除去培养基中的酯酶。
4. 用 PBS 制备细胞悬液，其中细胞密度为 1x105至 1x106 细胞/ ml。
5. 将 200μl 细胞悬液移至 EP 管中。然后将 100μl 染色溶液添加到细胞中。混匀并在 37℃ 下孵育 15 分钟，避光。 注意：如果需要，将孵育时间延长至 30 分钟。
6. 如果使用荧光显微镜，则将 10μl 细胞和染色液放在载玻片上，并盖上盖玻片。 使用 490 nm 激发波长来检测荧光，可以同时监测活细胞和死细胞。在 545 nm 激发下，只能观察到死细胞。 您也可以使用流式细胞仪或其他机器。
预实验
如果需要确定每种试剂的最佳浓度，请按照以下步骤操作：
1. 使用 0.1％皂苷或 0.1-0.5％洋地黄皂苷孵育细胞 10 分钟来制备死细胞。或者在 70％乙 醇中孵育 30 分钟。
2. 用 0.1-10 μM PI 溶液染色死细胞，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最 佳工作浓度。 用 0.1-10 μM Calcein-AM 溶液染色死细胞以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用 此浓度进行活细胞染色，观察是否活细胞能被染色。
注意
1. 处理剩余的染料溶液时，请遵循有毒溶液处理准则和规定，并将处理委托给工业废物处 理公司。
2. 在以前的实验中，CFSE 在一篇论文中被报道荧光染料被保留在细胞内长达 8 周。而 Calcein-AM 和 BCECF-AM 的被观察到荧光可以保持长达三天。
3. 如果染色后染料似乎没有留在活细胞内，则可能是因为活细胞由于细胞功能而将染料排 出，或者使用的试剂不足。
