Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH

Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH测定生物体液中ACE2活性

本实验方案根据研究内容整理，仅供参考，请根据实际需求进行调整。

1.试剂准备

（1）ACE2底物溶液：将Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH（15mM储备液，用1% NH₄OH配制）与蛋白酶抑制剂NEM（100mM）和PMSF（100mM）按比例加入预冷的MES缓冲液（50mM MES, 300mM NaCl, 10μM ZnCl₂, pH=6.8）中，使终浓度分别为15μM、1mM和1mM。

（2）ACE2标准品：重组人ACE2或小鼠ACE2用PBS稀释至10μg/mL，使用时进一步梯度稀释至1.56–50ng/mL的标准曲线范围。

（3）ACE2抑制剂：MLN-4760（10μM）或DX600（10μM），用于特异性活性验证。

2. 生物样本预处理

（1）尿液：采集后立即冰浴，离心（12000×g, 5min, 4°C），取上清，-80°C保存。检测前稀释至少1:2。

（2）血浆：肝素抗凝血离心（3,000×g, 10min, 4°C）分离血浆，-80°C保存。检测前稀释1:7.5。

（3）细胞培养上清：无血清培养的细胞上清直接离心取上清，无需稀释。

3.ACE2活性检测步骤

（1）在黑色96孔板中每孔加入10μL抑制剂（MLN-4760或DX600）或ddH₂O（对照）。

（2）加入75μL ACE2底物/缓冲液混合液，再加入15μL稀释后的生物样本或ACE2标准品，总反应体积100μL。

（3）用密封膜和铝箔避光，室温震荡孵育16小时。

（4）使用荧光酶标仪检测（激发波长320nm，发射波长405nm），读取相对荧光单位（RFU）。

注意事项：

（1）高背景荧光样本（如浓尿液）需进一步稀释，葡萄糖、尿素、肌酐和白蛋白不干扰检测结果。

（2）避免使用含EDTA的采血管或血清（含ACE2活性），pH需稳定在6.8±0.2。

（2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

References:

[1] Xiao F, Burns KD. Measurement of Angiotensin Converting Enzyme 2 Activity in Biological Fluid (ACE2). Methods Mol Biol. 2017;1527:101-115.