FerroOrange (Fe2+ indicator)

1.1 从冰箱取出FerroOrange，置于室温解冻，将其置于微量离心机内低速离心。将瓶内的粉末离心到管底后，再开盖。

1.2 往一管FerroOrange(24μg)内加入35μL DMSO，用枪反复吹吸混匀，使其完全溶解制备1mM FerroOrange储存液。若单次不能用完储存液，请分装并置于-20℃避光保存，一个月内使用。

1.3 于正式实验前，用中性缓冲液或无血清培养基来稀释1mM FerroOrange储存液到所需工作浓度(比如:1uM)，工作液需现配现用，尽快用完。【注意:酸性溶液会氧化FerroOrange，严重影响探针的效率】。

2. 荧光显微镜操作方法

2.1.细胞接种于荧光培养皿中，在37℃，5% CO₂培养箱中孵育过夜。

2.2.弃去上清液，并用HBSS或无血清培养基洗涤细胞3次。

2.3.更换含有药物的培养基，在37℃，5% CO₂培养箱中孵育。

* 请根据药物特性优化孵育时间。

2.4.加入浓度为1 μM的FerroOrange工作液，在37℃，5% CO₂培养箱中孵育30分钟。

* 加入FerroOrange染色剂后直接观察，不要洗涤。

2.5.在荧光显微镜下观察细胞。

3. 流式细胞仪操作方法

3.1将1 x 10⁵个HeLa细胞（MEM培养基，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）接种到6孔板中，并在37℃、5% CO₂孵育箱中培养过夜。

3.2用无血清培养基（2 mL）三次洗涤细胞。

3.3向对照组细胞中加入无血清培养基（1 mL），硫酸铵亚铁处理组加入10mM的硫酸铵亚铁（10μL）（最终浓度：100μM）的无血清培养基。

3.4在37℃孵育箱中孵育细胞20分钟，并用HBSS（1 mL）三次洗涤细胞

3.5经胰蛋白酶消化（250 µL）后，用含血清的培养基（1 mL）停止反应，将1.25毫升的细胞悬液转移到微离心管中。

3.6 将细胞悬液以1,500转/分的速度离心3分钟。

3.7丢弃上清液，并向微离心管中加入HBSS（1 mL），通过振荡混合。

3.8将细胞悬液以1,500转/分的速度离心3分钟，并丢弃上清液。

3.9向细胞中加入1μM的FerroOrange和无血清培养基的MEM（300μL）。

3.10在37℃孵育箱中孵育细胞15-30分钟。

3.11染色细胞经过细胞过滤器过滤，并使用流式细胞仪分析样本。

4. 荧光检测

4.1对于荧光显微镜:通用的G激发滤片比如Cv3检测用的滤片。

4.2对于激光显微镜和流式细胞仪:532nm，514nm或561nm激光器用于激发。实在没有，亦可用488nm激光器。发射波长为580nm。

图1 FerroOrange 染色硫酸亚铁铵处理的Hela细胞

5. 荧光酶标仪操作方法

5.1 进行组别设置

样品A：无添加剂(仅HeLa细胞)。

样品B：添加了铁螯合试剂2,2`-bipyridyl(Bpy)（GC61754）的HeLa细胞。

样品C：添加铁(硫酸铵铁)（GC20135）的HeLa细胞。

5.2 在96孔黑板(透明底)上接种100 µl HeLa细胞悬液，使其达到10,000 cells/well，在37℃  5% CO₂ 培养箱中过夜培养。

5.3 样品C的细胞用MEM(不含FBS)100 µl洗涤3次。

5.4 向样品C中添加100 μl硫酸铵铁(II)/MEM(不含FBS) (最终浓度: 100 µM)，在37℃  5% CO₂培养箱中静置30分钟。

5.5 用100 µl HBSS洗涤所有孔的细胞3次。

5.6 向样品A和C中添加100 μl的1 µM FerroOrange working solution ，向样品B中添加100 μl含有FerroOrange(最终浓度:1 µM)和Bpy(最终浓度:100 µM)的HBSS溶液，在37℃ 5%CO₂培养箱中培养30分钟。

5.7 用多功能读板器检测各样品的荧光强度(Ex:543 nm,Em:580 nm)。

图2 荧光酶标仪检测结果

注：该方案仅提供指导，应根据您的具体需求进行修改。