Dilute-Free Rapid Gold BCA Protein Assay

1. 微孔酶标仪检测法：

1.1. 将10μL的每种BSA标准品和蛋白质样品添加到单独的微孔板孔中。

注意：如果蛋白样品十分珍贵，可以使用PBS将蛋白样品稀释5-10倍，并在计算蛋白浓度时乘以稀释倍数。

1.2. 以50:1的比例混合BCA试剂A和BCA试剂B。即将50mL BCA试剂A与1mL BCA试剂B混合。

注意：使用以下公式确定所需工作试剂的总量，建议多配1-2个孔的工作液：

（标准品+待测样品） * （重复次数）*（每个样品所需要的BCA工作液）=所需BCA工作液总体积。

注意：建议显色工作液现用现配，在室温下，工作液会逐渐变为深绿色，但只要在 30min内使用，对定量的准确性不会造成影响。

1.3. 向每个孔中添加200μL BCA工作试剂并混合。

1.4. 密封板并室温孵育5分钟。

1.5. 在微孔酶标仪上测量480 nm的吸光度。

注意：孵育时间可适当延长，若测量得到宽范围（0-10mg/mL）的线性信号，孵育时间不宜超过15分钟。本试剂盒检测结果是动态的，吸光值一直在增加，显色反应速度较快。也可加入 50μL 的 1M HCI终止反应延长检测时间，但尽量在 1小时内完成检测，以尽可能减小对实验结果的影响。

1.6. 从所有读数中减去空白的OD480，绘制BSA标准曲线: OD480（在Y轴上）对BSA标准浓度（在X轴上）。计算每个待测样品的蛋白质浓度。

2. 分光光度计检测法：

2.1. 将50μL的每种BSA标准品和蛋白质样品添加到EP管中。

注意：如果蛋白样品十分珍贵，可以使用PBS将蛋白样品稀释5-10倍，并在计算蛋白浓度时乘以稀释倍数。

2.2. 以50:1的比例混合BCA试剂A和BCA试剂B。即将50mL BCA试剂A与1mL BCA试剂B混合。

注意：使用以下公式确定所需工作试剂的总量，建议多配1-2个样品的工作液：

（标准品+待测样品） *（重复次数） * （每个样品所需要的BCA工作液）=所需BCA工作液总体积。

注意：建议显色工作液现用现配，在室温下，工作液会逐渐变为深绿色，但只要在 30min内使用，对定量的准确性不会造成影响。

2.3. 向每个孔中添加1000μL BCA工作液并混合均匀。

2.4. 室温孵育5分钟。

2.5. 用分光光度计测量每个样品以及480 nm的吸光度。

注意：孵育时间可适当延长，若测量得到宽范围（0-10mg/mL）的线性信号，孵育时间不宜超过15 分钟。本试剂盒检测结果是动态的，吸光值一直在增加，显色反应速度较快。为了避免人工操作时间差导致的测量误差，建议加入250μL的 1M HCI终止反应，在 1小时内完成检测，以尽可能减小对实验结果的影响。

2.6. 从所有读数中减去空白的OD480，绘制BSA标准曲线: OD480（在Y轴上）对BSA标准浓度（在X轴上）。计算每个待测样品的蛋白质浓度。

注意事项：

1.  一系列不同浓度的蛋白标准请全部在室温融化后混匀使用。

2. 试剂A 和试剂 B 混合成工作液时可能会有浑浊，但充分振荡混匀后就会消失。

3. 需酶标仪一台，测定波长为 480nm；需96孔板。如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但是测定蛋白浓度时，需根据测定吸光度的杯子的体积，按比例调整A液，B液和样品的体积，每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。

4. 室温（25℃左右）放置5分钟左右即可测定，如果在室温放置5分钟后样品没有充分显色，孵育时间可适当延长至10-15分钟。但孵育时间过长会导致高浓度的蛋白标准品的吸光度达到平台而不能被用于线性标准曲线的计算，建议控制好孵育温度和时间。

5. BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达 5%的 SDS，5%的 Triton X-100，5%的Tween 20/60/80。BCA检测受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保 EDTA 低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于 1mM。如发现样品稀释液或裂解液本身就有较高背景，请试用Bradford法蛋白定量试剂盒（目录号：GK10027。或者透析/除盐，ACETONE/TCA沉淀蛋白后重溶于超纯水等方法来消除干扰物质的影响。

6. 所有试剂需平衡至室温后再使用，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。

7. 建议绘制标准曲线所用标准品与待测样本同步进行显色反应与吸光值测定，以获得准确测定值，建议每次测定蛋白样本时，都绘制标准曲线。

8. 若无法测定指定波长（480nm）处吸光值，可以在 460-500nm 之间的任何波长下测定，但标准曲线斜率和总体检测灵敏度将略有降低（<10%）。