原液制备
1. 蛋白准备
为了获得最佳标记效果，请将蛋白 (抗体) 浓度配制为 2 mg/mL。
1) 蛋白溶液 pH 值应为 8.5±0.5，若 pH 低于 8.0，则用 1 M 碳酸氢钠进行调整。
2) 若蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率会大大降低，为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
3) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 和铵离子的缓冲液中，否则会影响标记效率。
2. 染料准备
将无水 DMSO 稀释 CY 染料，制成 10 mM 储备溶液。通过玻璃管或旋涡充分混合。
注:CY 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存。
3. 染料工作液用量计算
标记反应所需的 CY 染料用量取决于要标记蛋白的用量，CY 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。
例:假如所需标记蛋白为 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000),用 100 μL DMSO 溶解一管 1 mg CY 染料，则所需 CY 体积为 3.95 μL，详细计算流程如下 (以 Cy5.5-SE 为例) :
1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG) ×mL (IgG) / MW (IgG) =2 mg/mL×0.5 mL / 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol
2) mmol (Cy5.5-SE) = mmol (IgG) ×10 =6.7×10-6 mmol×10 = 6.7×10-5 mmol
3) μL (Cy5.5-SE) = mmol (Cy5.5-SE) ×MW (Cy5.5-SE) / mg/μL (Cy5.5-SE) = 6.7×10-5 mmol× 590.15 mg/mmol / 0.01 mg/μL =3.95 μL (Cy5.5-SE)
使用方法
1. 标记反应
1) 取算好体积的新鲜配制的 10 mg/mL CY 染料缓慢加入到 0.5 mL 蛋白样品溶液中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀，防止蛋白样品变性失活。
2) 将该反应小管置于避光处，在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟，每隔 10-15 分钟，将反应小管轻轻颠倒几次，以充分混合两种反应物，提高标记效率。
2. 蛋白纯化脱盐
以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料蛋白偶联物为例。
1) 按照生产说明书制备 SepHadex G-25 柱。
2) 将反应混合物装入 SepHadex G-25 色谱柱顶部。
3) 当样品运行到顶部树脂表面下方时，立即加入 PBS (pH 7.2-7.4)。
4) 向所需样品中加入更多的 PBS (pH 7.2-7.4),完成柱纯化。结合含有所需要的染料-蛋白质缀合物的组分。
Cy5.5 标记的因子 VIIa 是为肿瘤成像而开发的。用这些靶向蛋白标记的 Cy5.5 特异性定位于肿瘤异种移植物至少 14 天，但未结合的 Cy5.5 不定位于任何异种移植物或器官。这种对肿瘤 VEC 中的抗组织因子进行成像的方法可用于检测原发性肿瘤和转移灶，以及监测体内治疗反应[1]。与 Cy5.5 标记的乳铁蛋白结合的 pH/温度敏感磁性纳米凝胶（Cy5.5-Lf-MPNA 纳米凝胶）被开发为胶质瘤术前 MRI 和术中荧光成像的有前途的造影剂[2]。
[1]. Zhu S, et al. Visualizing cancer and response to therapy in vivo using Cy5.5-labeled factor VIIa and anti-tissue factor antibody. J Drug Target. 2015 Apr;23(3):257-65.
[2]. Ptaszek M. Rational design of fluorophores for in vivo applications. Prog Mol Biol Transl Sci. 2013;113:59-108.
[3]. Shindy, H. A. (2017). Fundamentals in the chemistry of cyanine dyes: A review. Dyes and Pigments, 145, 505-513. doi:10.1016/j.dyepig.2017.06.029
[4]. Jiang L, et al. pH/temperature sensitive magnetic nanogels conjugated with Cy5.5-labled lactoferrin for MR and fluorescence imaging of glioma in rats. Biomaterials. 2013 Oct;34(30):7418-28.
[5]. Lim B, et al. A Unique Recombinant Fluoroprobe Targeting Activated Platelets Allows In Vivo Detection of Arterial Thrombosis and Pulmonary Embolism Using a Novel Three-Dimensional Fluorescence Emission Computed Tomograp (FLECT) Technology. Theranostics. 2017 Feb 26;7(5):1047-1061.
