Cal-520 AM,Cell Permeant

使用方法：

A，试剂准备

1)配Puronic F-127母液:称100mg Pluronic F-27粉末(货号: GB30090) 中500ul DMS0,配制成20%（W/V）DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2) HHBS Buffer (1X Hank's Balanced Salt Solution with 20mM HEPES bufer, pH 7.2-7.4)或者其他生理缓冲液

B，操作步骤

1) 用无水DMSO溶解Cal-520 AM配制成2-5mM的储存液，或将已配好的Cal-520 AM储存液取出于室温回。(如: 若制成4mM的母液，需向50ug Cal-520 AM中加入11.3ul 无水DMSO)。

2) 用HHBS或其他生理缓冲液将Cal-520 AM+DMSO储存液稀释到含0.04% Pluronic F-127的10-20uM染色工作液。

[注1] 添加一定量的20% Pluronic F-127溶液到Cal-520 AM+DMSO储存液，使Puronic F-127的浓度约为0.04%，Pluronic F-127可以防止AM深针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存.

[注2] Cal-520 AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5μM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化，为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

[注3] Cal-520 AM工作液需现配现用，避免反复冻存。

3) [可选] 如果细胞内(比如CHO细胞)含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2mM) 可能需要入上述染色工作液内(在孔内的最终浓度为0.5-1mM)，以降低去酯化探针的泄露水平。

4) 加入等体积的染色工作液到细胞培养孔内，37°C孵育60-90min。然后，室温再孵育30min.

[注1] 某些细胞系探针的加载时间长于2h能提供更好的信号.

5)吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓中液(如有必要，使用含转运体抑制剂如1mM丙磺舒的缓冲液)清洗细胞1-2次，以去除残留探针。

6)之后在HHBS或其他生理缓中液(如有必要，使用含转运体抑制剂如1mM丙磺舒的缓冲液)中，用激发/发射波长492/514 nm来检测荧光。