Azide-A-DSBSO crosslinker是一种质谱(MS)可裂解、膜渗透性、同源双功能、叠氮标记、酸可裂解的交联肽。
Cas No.:1704097-02-8
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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Azide-A-DSBSO crosslinker is a mass spectrometry (MS)-cleavable, membrane-permeable, homobifunctional, azide-labeled, acid-cleavable cross-linked peptide [1]. Azide-A-DSBSO crosslinker carries a bio-orthogonal azide tag that functions as an enrichment handle permitting selective isolation of cross-linked proteins and peptides through azide-based conjugation chemistry and subsequent affinity purification [2]. Azide-A-DSBSO has been used for studying protein-protein interactions (PPI), especially suitable for the study of PPI in living cells[3].
References:
[1] Kaake R M, Wang X, Burke A, et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein–protein interactions in living cells[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2014, 13(12): 3533-3543.
[2] Matzinger M, Kandioller W, Doppler P, et al. Fast and highly efficient affinity enrichment of Azide-A-DSBSO cross-linked peptides[J]. Journal of Proteome Research, 2020, 19(5): 2071-2079.
[3] Burke A M, Kandur W, Novitsky E J, et al. Synthesis of two new enrichable and MS-cleavable cross-linkers to define protein–protein interactions by mass spectrometry[J]. Organic & biomolecular chemistry, 2015, 13(17): 5030-5037.
Azide-A-DSBSO crosslinker是一种质谱(MS)可裂解、膜渗透性、同源双功能、叠氮标记、酸可裂解的交联肽[1]。Azide-A-DSBSO crosslinker携带一个生物正交叠氮标签，该标签可作为富集柄，通过基于叠氮的共轭化学和随后的亲和纯化，实现交联蛋白质和肽的选择性分离[2]。Azide-A-DSBSO crosslinker已用于研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），尤其适用于活细胞中PPI的研究[3]。
Azide-A-DSBSO crosslinker用于质谱分析本方案仅提供指导，可根据您的具体需要进行修改
（1）制备储备液：在无水DMSO中制备浓度为40mM的Azide-A-DSBSO crosslinker储备液。注意事项：使用前请立即准备。避免冻融循环。
（2）配制工作液：用PBS稀释储备液，配制浓度为1mM的工作液。请根据实际情况调整工质浓度，并立即准备，避免反复冻融。注意：实验当天的工作溶液必须是新鲜的。
使用下表计算交联反应所需试剂的体积。
|
Reagent |
Final Concentration in Mixture |
Stock Concentration |
|
Protein sample |
0.5-2mg/ml |
Varies |
|
Azide-A-DSBSO crosslinker |
1mM |
40mM in DMSO |
|
DMSO |
≤5% (v/v) |
- |
|
Cross-linking buffer (HEPES or PBS) |
50mM |
- |
|
Quenching reagent (Tris-HCl, pH 7.5) |
100mM |
1M |
2. 制备蛋白质样品（纯化样品或细胞裂解液）
（1）在交联缓冲液（50mM HEPES，pH 7.5）中制备蛋白质样品。确保样品中不含会干扰NHS酯反应的含胺化合物（例如Tris、甘氨酸或铵盐）。
（2）将蛋白质浓度调整至0.5-2mg/ml。对于细胞裂解液，于4°C下以17000×g离心15分钟以去除碎片，并使用BCA或Bradford法测定蛋白质浓度。
（3）如有必要，向混合物中加入DMSO以确保相容性，最终DMSO浓度≤5%。
3. 交联反应及分析
（1）加入Azide-A-DSBSO crosslinker工作溶液，立即通过涡旋或移液器混合。
（2）在室温（25°C）下温和振荡孵育反应60分钟。
（3）通过加入1M Tris-HCl（pH 7.5）至终浓度为100mM来终止交联反应。充分混合，并在室温下孵育 15分钟。
（4）使用脱盐柱（MWCO 6-8kDa）或通过PBS透析去除多余的交联剂。
（5）加入DTT至终浓度为10mM以还原二硫键。在37°C下孵育60分钟（或在56°C下孵育30分钟）。
（6）通过添加碘乙酰胺（IAA）至终浓度为 20mM来烷基化游离的硫醇。在室温避光条件下孵育30分钟。通过添加二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为5mM并孵育15分钟来终止剩余的IAA。
（7）用50mM、pH 7.5的HEPES稀释样品，以将脱氧胆酸钠浓度降低至1%。以1:50 (w/w)的比例加入赖氨酰内肽酶（LysC），在37°C下孵育2小时。随后以1:50 (w/w) 的比例加入胰蛋白酶，在37°C下孵育过夜（16小时）。
（8）对于使用DBCO-琼脂糖珠进行点击化学富集，用PBS洗涤DBCO-琼脂糖珠（每个样品30-50μl悬浮液）三次。将消化后的肽混合物与洗涤过的DBCO-琼脂糖珠混合。在室温下轻轻旋转孵育 2-4小时。通过离心（1000×g；2分钟）沉淀珠子并丢弃上清液。依次洗涤珠子：3次1ml PBS；2次1ml含 0.1% SDS的PBS；2次1ml含6M尿素的PBS；3次1ml含100mM碳酸氢铵。
（9）用酸解法从磁珠上洗脱交联肽，将磁珠与0.1%三氟乙酸（TFA）或甲酸在37°C下孵育30分钟，以裂解酸不稳定的C-S键。
（10）在浓缩器中干燥洗脱的肽。用0.1%甲酸重新溶解，用于LC-MS/MS分析。
4. 注意事项：
（1）为了您的安全和健康，请在操作时穿戴实验服和一次性手套。
（2）本方案及所有试剂仅供科学研究使用。
References:
[1] Jiang P L, Zhu Y, Cai J, et al. Optimized In‐Solution and Gas‐Phase Chemistry Enables High‐Efficiency Interactome Mapping by DSBSO‐Based Cross‐Linking Mass Spectrometry[J]. Angewandte Chemie, 2025: e18355.
[2] Matzinger M, Kandioller W, Doppler P, et al. Fast and highly efficient affinity enrichment of Azide-A-DSBSO cross-linked peptides[J]. Journal of Proteome Research, 2020, 19(5): 2071-2079.
| Cas No. | 1704097-02-8 | SDF | |
| 分子式 | C24H33N5O12S2 | 分子量 | 647.68 |
| 溶解度 | DMSO : 100 mg/mL (154.40 mM; Need ultrasonic; Hygroscopic DMSO has a significant impact on the solubility of product, please use newly opened DMSO) | 储存条件 | -20°C, sealed storage, away from moisture |
| General tips | 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。 储备液的保存方式和期限：-80°C 储存时，请在 6 个月内使用，-20°C 储存时，请在 1 个月内使用。 为了提高溶解度，请将管子加热至37℃，然后在超声波浴中震荡一段时间。 |
||
| Shipping Condition | 评估样品解决方案：配备蓝冰进行发货。所有其他可用尺寸：配备RT，或根据请求配备蓝冰。 | ||
| 制备储备液 | |||
 |
1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 1.544 mL | 7.7199 mL | 15.4397 mL |
| 5 mM | 308.8 μL | 1.544 mL | 3.0879 mL |
| 10 mM | 154.4 μL | 772 μL | 1.544 mL |
| 第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量） | ||||||||||
| 给药剂量 | mg/kg |  |
动物平均体重 | g | |
每只动物给药体积 | ul | |
动物数量 | 只 |
| 第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶于水的药物；不同批次药物配方比例不同，请联系GLPBIO为您提供正确的澄清溶液配方） | ||||||||||
| % DMSO % % Tween 80 % saline | ||||||||||
| 计算重置 | ||||||||||
计算结果:
工作液浓度： mg/ml；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL，
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL saline，混匀澄清。
1. 首先保证母液是澄清的；
2.
一定要按照顺序依次将溶剂加入，进行下一步操作之前必须保证上一步操作得到的是澄清的溶液，可采用涡旋、超声或水浴加热等物理方法助溶。
3. 以上所有助溶剂都可在 GlpBio 网站选购。
Quality Control & SDS
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- Purity: >98.00% Appearance: A solid
- COA (Certificate of Analysis)
- SDS (Safety Data Sheet)
- Datasheet