AQC

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。

1、蛋白制备

（1）为获得最佳标记效果，请制备蛋白 (抗体) 浓度为 2mg/mL。

（2） 蛋白溶液的 PH 值为 8.5±0.5。如果 pH 值低于 8.0，应使用 1M 碳酸氢钠进行调节。

（3） 如果蛋白浓度低于 2mg/mL，标记效率会大大降低。为获得最佳标记效率，建议终蛋白浓度范围为 2-10mg/mL。

（4）蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 的缓冲液中，并且铵离子，否则会影响标记效率。

2、染料制备 (以 AQC 为例)

（1）将无水 DMSO 加入 AQC 小瓶中，制成 10mM 储备液。通过移液器或涡旋混合均匀。

3、染料用量的计算

（1）反应所需的 AQC 的量取决于待标记蛋白的量，AQC 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。

（2）Example：假设所需的 marker protein 为 500μL 2mg/mL IgG (MW=150,000)，用 100μL DMSO 溶解 1mg AQC，得到所需的 AQC 体积为 1.9μL，详细计算过程如下：

mmol (IgG) =mg/mL (IgG) ×mL (IgG)/MW (IgG) =2mg/mL × 0.5mL/150,000mg/mmol= 6.7×10^-6mmol

mmol (AQC) =mmol (IgG) × 10=6.7×10^-6 mmol×10=6.7 × 10^-5 mmol

μL (AQC) = mmol (AQC) ×MW (AQC)/mg/μL (AQC) =6.7 ×10^-5mmol ×285.25mg/mmol/0.01mg/μL=1.9 μL (AQC)

4、运行偶联反应

（1）将适量新鲜制备的 10mg/mL AQC 缓慢加入到 0.5mL 蛋白质样品中在溶液中，轻轻摇动混匀，然后短暂离心，将样品收集在反应管底部。请勿混匀，以免蛋白样品变性失活。

（2）将反应管在室温下在黑暗中孵育，每 10-15 分钟轻轻旋转一次，总共 60 分钟。

5、纯化偶联物（以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料-蛋白偶联物的示例）

（1）根据制造说明准备 SepHadex G-25 柱。

（2）将反应混合物加载到 SepHadex G-25 柱的顶部。

（3） 一旦样品在顶部树脂表面下方运行，立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。

（4）向所需样品添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。

References:

[1]Bosch L, Alegría A, Farré R. Application of the 6-aminoquinolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamate (AQC) reagent to the RP-HPLC determination of amino acids in infant foods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2006 Feb 2;831(1-2):176-83.