Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
一、 细胞悬浮染色：
1、悬浮细胞染色
（1）细胞经1000g离心5分钟，弃上清，用适量PBS轻轻重悬细胞并计数。
注意：PBS重悬细胞也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合不受干扰，此步骤不可省略。
（2）取约5-10×10⁴个细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V Binding Buffer轻柔重悬细胞。
（3）加入5μl Annexin V-FITC和10μl Propidium Iodide染色液，轻柔混匀。
（4）室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。
注意：孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。
（5）1000g离心5分钟，弃上清，使用PBS重悬细胞，将样本转移至冰浴中，建议使用铝箔避光处理。
（6）使用流式细胞仪或荧光显微镜对染色结果进行检测。

2. 对于贴壁细胞的消化后检测：
（1）（重要）将细胞培养基吸出，转移至合适大小的离心管内。
（2）（关键）使用PBS轻柔清洗一次贴壁培养的细胞，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞，室温孵育至细胞形状逐渐变圆并变得松散、轻轻晃动出现细胞脱落，立即向消化好的细胞中加入步骤（1）收集的细胞培养基终止消化，将细胞轻柔吹打下来。
注意：
① 建议在此步骤使用步骤（1）中收集的细胞培养基终止消化，也能够收集悬浮在培养基的发生凋亡或坏死的细胞。
② 胰酶消化需要适当。消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜损伤，从而导致细胞坏死的假阳性；消化时间如果过长，同样易造成细胞膜损伤而出现假阳性，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合，从而干扰对细胞凋亡的检测。
③ 胰酶细胞消化液中应尽量不含EDTA。Annexin V是Ca²⁺依赖的蛋白，EDTA可以螯合Ca²⁺，从而影响Annexin V和磷脂酰丝氨酸（PS）结合，影响实验结果。
④ 如果使用含EDTA的胰酶消化细胞，建议在消化结束后、加Annexin V-FITC前使用PBS多清洗几次细胞，能够去除EDTA对凋亡检测的影响。
（3）将细胞液转移至离心管中，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。
注意：此步骤应尽量去除胰酶，残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC，影响染色效果。
（4）取约5-10×10⁴个细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V Binding Buffer轻柔重悬细胞。
（5）加入5μl Annexin V-FITC和10μl Propidium Iodide染色液，轻轻混匀，室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。
注意：孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。
（6）1000g离心5分钟，弃上清，使用PBS重悬细胞，将样本转移至冰浴中，建议使用铝箔避光处理。
（7）使用流式细胞仪或荧光显微镜对染色结果进行检测。

二、贴壁细胞的原位荧光检测：
1、(选做)如果条件允许，建议在凋亡诱导结束后将多孔板经1000g离心5分钟。
2、吸弃细胞培养基，加入PBS洗涤一次。如果条件允许，建议在吸弃PBS前将多孔板经1000g离心5分钟。
3、加入195μl Annexin V Binding Buffer。
4、加入5μl Annexin V-FITC和10μl Propidium Iodide染色液，轻轻混匀，室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。
5、1000g离心5分钟，弃上清，使用PBS洗涤细胞，将样本转移至冰浴中，建议使用铝箔避光处理。
6、使用荧光显微镜对染色结果进行检测。

注意事项：
1、 细胞在染色后应尽快检测，建议在1小时之内完成检测，不建议将细胞在结合液中保存过久。
2、 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，最大激发光/发射光波长为525/530nm，也能够使用488通道激发；碘化丙啶(PI)为红色荧光，结合核酸后的最大激发光/发射光波长为535/617nm。
3、 染色完成后可以不更换掉染色液，直接上机检测。如果不能立即检测，建议离心去除染色液，使用PBS或Annexin V Binding Buffer重悬细胞。
4、 如果细胞在悬浮染色后使用荧光显微镜检测，建议1000g离心5分钟收集细胞，使用50-100μl Annexin V Binding Buffer轻轻重悬细胞，涂片后在荧光显微镜下观察。
5、 在初次使用流式细胞仪进行检测时，建议设置未染色、PI单染和Annexin V-FITC单染3组对照。
6、 在使用流式细胞仪进行检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测。
7、 本产品只适用于细胞模型的凋亡双染，也适用于检测精子凋亡，但不能用于检测组织样本中的凋亡。
8、 不同细胞系对PI的敏感度不同，请根据染色情况酌情调整PI用量。
9、 Annexin V-FITC通过结合磷脂酰丝氨酸（PS）对凋亡细胞进行标记，PS在不同种属间相对保守，故而本产品适用于对不同种属的细胞进行凋亡检测，具体实验步骤可参考相关文献。
10、 本产品能够和抗体一起对细胞进行染色，但建议分开染色，建议在抗体染色完成后将缓冲液更换为Annexin V Binding Buffer进行凋亡检测。
11、 如果样品来源于血液，必须去除血液中的血小板，血小板中的PS会干扰实验结果。
12、 神经细胞膜容易破坏外翻，从而导致假阳性，所以本产品不适用于检测神经细胞的凋亡。
13、 操作中务必动作轻柔，离心后需确认管底是否有细胞。
14、 荧光染料均存在淬灭问题，实验过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
15、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。