Annexin V-AF647/PI Apoptosis Kit

规格	价格	库存	数量
100assays	¥1,450.00	现货	1
20assays	¥450.00	现货	1
50assays	¥900.00	现货	1

产品描述 Description

Annexin V-AF647/PI Apoptosis Kit（Annexin V-AF647/PI细胞凋亡检测试剂盒）是一种使用AF647标记的Annexin V蛋白来检测细胞凋亡水平的凋亡检测类试剂盒。

Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，广泛分布于真核细胞细胞浆内，参与细胞内的信号转导。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧；在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸发生翻转，AF647标记的Annexin V能够与翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合，从而标记凋亡细胞。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V-AF647可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现红色荧光（Ex/Em：650/670nm）。通过流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备能够对凋亡情况进行检测。

本试剂盒也提供了一份PI染色液。PI是一种高亲和力核酸染色剂，仅能穿透质膜受损的细胞，可以使坏死细胞或凋亡晚期细胞的细胞核呈现红色荧光（Ex/Em：535/617nm），而活细胞和凋亡早期细胞则有PI拒染的现象。

经Annexin V-AF647和PI联合染色后，正常细胞基本无荧光（Annexin V-/PI-），早期凋亡细胞呈Annexin V-AF647阳性（Annexin V+/PI-），晚期凋亡细胞及坏死细胞则呈Annexin V-AF647和PI阳性（Annexin V+/PI+）。

实验参考方法 Experimental Reference Method

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。

一、细胞悬浮染色：

1、悬浮细胞染色

（1）细胞经1000g离心5分钟，弃上清，用适量PBS轻轻重悬细胞并计数。

注意：PBS重悬细胞也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-AF647的结合不受干扰，此步骤不可省略。

（2）取约5-10×10⁴个细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V Binding Buffer轻柔重悬细胞。

（3）加入5μl Annexin V-AF647和10μl PI染色液，轻柔混匀。

（4）室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。

注意：孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。

（5）1000g离心5分钟，弃上清，使用PBS重悬细胞，将样本转移至冰浴中，建议使用铝箔避光处理。

（6）使用流式细胞仪或荧光显微镜对染色结果进行检测。

2. 对于贴壁细胞的消化后检测：

（1）（重要）将细胞培养基吸出，转移至合适大小的离心管内。

（2）（关键）使用PBS轻柔清洗一次贴壁培养的细胞，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞，室温孵育至细胞形状逐渐变圆并变得松散、轻轻晃动出现细胞脱落，立即向消化好的细胞中加入步骤（1）收集的细胞培养基终止消化，将细胞轻柔吹打下来。

注意：

① 建议在此步骤使用步骤（1）中收集的细胞培养基终止消化，也能够收集悬浮在培养基的发生凋亡或坏死的细胞。

② 胰酶消化需要适当。消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜损伤，从而导致细胞坏死的假阳性；消化时间如果过长，同样易造成细胞膜损伤而出现假阳性，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-AF647的结合，从而干扰对细胞凋亡的检测。

③ 胰酶细胞消化液中应尽量不含EDTA。Annexin V是Ca²⁺依赖的蛋白，EDTA可以螯合Ca²⁺，从而影响Annexin V和磷脂酰丝氨酸（PS）结合，影响实验结果。

④ 如果使用含EDTA的胰酶消化细胞，建议在消化结束后、加Annexin V-AF647前使用PBS多清洗几次细胞，能够去除EDTA对凋亡检测的影响。

（3）将细胞液转移至离心管中，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。

注意：此步骤应尽量去除胰酶，残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-AF647，影响染色效果。

（4）取约5-10×10⁴个细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V Binding Buffer轻柔重悬细胞。

（5）加入5μl Annexin V-AF647和10μl PI染色液，轻轻混匀，室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。

注意：孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。

（6）1000g离心5分钟，弃上清，使用PBS重悬细胞，将样本转移至冰浴中，建议使用铝箔避光处理。

（7）使用流式细胞仪或荧光显微镜对染色结果进行检测。

二、贴壁细胞的原位荧光检测：

1、(选做)如果条件允许，建议在凋亡诱导结束后将多孔板经1000g离心5分钟。

2、吸弃细胞培养基，加入PBS洗涤一次。如果条件允许，建议在吸弃PBS前将多孔板经1000g离心5分钟。

3、加入195μl Annexin V Binding Buffer。

4、加入5μl Annexin V-AF647和10μl PI染色液，轻轻混匀，室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。

5、1000g离心5分钟，弃上清，使用PBS重悬细胞，将样本转移至冰浴中，建议使用铝箔避光处理。

6、使用荧光显微镜对染色结果进行检测。

注意事项：

1、细胞在染色后应尽快检测，建议在1小时之内完成检测，不建议将细胞在结合液中保存过久。

2、如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测。Annexin V-AF647的最大激发/发射波长为650/670nm，碘化丙啶结合核酸后的最大激发光/发射光波长为535/617nm。

3、染色完成后可以不更换掉染色液，直接上机检测。如果不能立即检测，建议离心去除染色液，使用PBS或Annexin V Binding Buffer重悬细胞。

4、如果细胞在悬浮染色后使用荧光显微镜检测，建议1000g离心5分钟收集细胞，使用50-100μl Annexin V Binding Buffer轻轻重悬细胞，涂片后在荧光显微镜下观察。

5、在初次使用流式细胞仪进行检测时，建议设置未染色、PI单染和Annexin V-AF647单染3组对照。

6、在使用流式细胞仪进行检测时，如果发现Annexin V-AF647单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-AF647稀释3-10倍后再进行检测。

7、本产品只适用于细胞模型的凋亡双染，也适用于检测精子凋亡，但不能用于检测组织样本中的凋亡。

8、 Annexin V-AF647通过结合磷脂酰丝氨酸（PS）对凋亡细胞进行标记，PS在不同种属间相对保守，故而本产品适用于对不同种属的细胞进行凋亡检测，具体实验步骤可参考相关文献。

9、本产品能够和抗体一起对细胞进行染色，但建议分开染色，建议在抗体染色完成后将缓冲液更换为Annexin V结合液进行凋亡检测。

10、如果样品来源于血液，必须去除血液中的血小板，血小板中的PS会干扰实验结果。

11、神经细胞膜容易破坏外翻，从而导致假阳性，所以本产品不适用于检测神经细胞的凋亡。

12、操作中务必动作轻柔，离心后需确认管底是否有细胞。

13、荧光染料均存在淬灭问题，实验过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

14、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

产品文档 Product Documents

批次：

Data Sheet

Components	20 Assays（20T）	50 Assays（50T）	100 Assays（100T）
Annexin V-AF647	100 μL	250 μL	500 μL
Propidium Iodide	200 μL	500 μL	1000 μL
Annexin V Binding Buffer	10 mL	25 mL	50 mL

功能属性

应用 & 特点	· High binding efficiency · Fast and convenient, only one simple staining procedure is required, and it can be completed in 10-20 minutes. · This kit can distinguish early and late apoptotic cells and necrotic cells through Annexin V-AF647 and PI staining.
运输方式	Ship with blue ice.
储存条件	冰袋（wet ice）运输。-20℃避光保存，避免反复冻融，一年有效。【注】：如果需要在短时间内多次重复使用，可以在4℃避光保存，半年有效。
用途	仅供研究使用!不能用于人体。