Alexa fluor 647 NHS ester

Protocol
一、蛋白制备
1) 为获得最佳标记效果，请制备蛋白 (抗体) 浓度为 2 mg/mL。
2) 蛋白溶液的 PH 值为 8.5±0.5。如果 pH 值低于 8.0，应使用 1 M 碳酸氢钠进行调节。
3) 如果蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率会大大降低。为获得最佳标记效率，建议终蛋白浓度范围为 2-10 mg/mL。
4) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 的缓冲液中，并且铵离子，否则会影响标记效率。
2.染料制备 (以 Alexa fluor 647 NHS ester 为例)
将无水 DMSO 加入 Alexa fluor 647 NHS ester 小瓶中，制成 10 mM 储备液。通过移液器或涡旋混合均匀。
3.染料用量的计算
反应所需的 Alexa fluor 647 NHS ester 的量取决于待标记蛋白的量，Alexa fluor 647 NHS ester 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。
Example：假设所需的 marker protein 为 500 μL 2 mg/mL IgG (MW=150,000)，用 100 μL DMSO 溶解 1 mg Alexa fluor 647 NHS ester，得到所需的 Alexa fluor 647 NHS ester 体积为 6.31 μL，详细计算过程如下：
1) mmol (IgG) =mg/mL (IgG) ×mL (IgG)/MW (IgG) =2 mg/mL × 0.5 mL/150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol
2) mmol (Alexa fluor 647 NHS ester) =mmol (IgG) × 10=6.7×10-6 mmol×10=6.7 × 10-5 mmol
3) μL (Alexa fluor 647 NHS ester) = mmol (Alexa fluor 647 NHS ester) ×MW (Alexa fluor 647 NHS ester)/mg/μL (Alexa fluor 647 NHS ester) =6.7 ×10-5 mmol × 942.06 mg/mmol/0.01 mg/μL=6.31 μL (Alexa fluor 647 NHS ester)
注意：我们建议使用 10:1 的染料/蛋白质摩尔比。如果浓度过低或过高，可将比例调整为 5:1、15:1 或 20:1。
4.运行偶联反应
1) 将适量新鲜制备的 10 mg/mL Alexa fluor 647 NHS ester 缓慢加入到 0.5 mL 蛋白质样品中
在溶液中，轻轻摇动混匀，然后短暂离心，将样品收集在反应管底部。请勿混匀，以免蛋白样品变性失活。
2) 将反应管置于避光处，在室温下间隔轻轻孵育 60 分钟。10-15 分钟，轻轻逆转反应
5.纯化偶联物
以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料-蛋白偶联物的示例。
1) 根据制造说明准备 SepHadex G-25 柱。
2) 将反应混合物加载到 SepHadex G-25 柱的顶部。
3) 一旦样品在顶部树脂表面下方运行，立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。
4) 向所需样品添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质偶联物的级分。